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From 2010.igem.org

August 18

【時間】　

9:00～

【実験担当】

岩城、古道、竹内、中村

【実験名】

(1)　BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）のストリーク

(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク

(3)　コンピタントセルの調整（17日の続き）

(4)　l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）のトランスフォーメーション

(5)　pSB3K3、pSB6のプレカルチャー（←前日の大量培養がコンタミした為）

(6)　pSB1A2の大量培養

(7)　pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ

【実験目的】

(1)　BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）のシングルコロニーを得る

(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る

(3)　作成したコンピタントセルの形質転換率の確認

(4)　l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）のトランスフォーメーション

(5)　19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する

(6)　pSB1A2の大量培養

(7)　pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ

【実験内容】

(1)　BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）のストリーク

　BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベートした（Overnight）

(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク

　BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート（+amp）にストリーク

　↓37℃でインキュベートした（Overnight）

(3)　コンピタントセルの調整（17日の続き）

　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした

　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した

　↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した

　↓吸光度測定した（＊実際は牛島さんに測っていただいた）

(4)　l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）のトランスフォーメーション

　l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）をDH5αにトランスフォーメーションした

　↓37℃でインキュベートした（Overnight）

(5)　pSB3K3、pSB6のプレカルチャー（←前日の大量培養がコンタミした為）

　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした

　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地（l）（+Km）、LB培地（l）（+amp）に植え継ぎ、37℃で振とう培養した

(6)　pSB1A2の大量培養

　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及び、pSB1C3を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋ｸﾛﾗﾑﾌｪﾆｺｰﾑ）に大量培養した

(7)　pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ

　大量培養させておいたpSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した

　↓比重計で、それぞれ等量を量った

　↓各チューブを4℃、4000×gで10min遠心した

　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした

　↓L7 4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置した

　↓N3 4mLを加えた

　↓室温、12,000×gで10min遠心した

　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた

　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した（×２）

　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した

＊以降の操作は翌日に繰り越した