Template:KIT-Kyoto-Augsut18

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(August 18)
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:(5) pSB3K3、pSB6のプレカルチャー(前日の大量培養がコンタミした為)
:(5) pSB3K3、pSB6のプレカルチャー(前日の大量培養がコンタミした為)
:(6) pSB1A2の大量培養
:(6) pSB1A2の大量培養
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:(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
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:(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ
【実験目的】
【実験目的】
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:(5) 19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する
:(5) 19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する
:(6) pSB1A2の大量培養
:(6) pSB1A2の大量培養
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:(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
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:(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ
【実験内容】
【実験内容】
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:: 前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及びpSB1C3を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+クロラムフェニコーム)に大量培養
:: 前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及びpSB1C3を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+クロラムフェニコーム)に大量培養
   
   
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:(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ
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:(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ
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:: 大量培養させておいたpSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した
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:: 大量培養させておいたpSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した  
:: ↓比重計で、それぞれ等量を量った
:: ↓比重計で、それぞれ等量を量った
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:: ↓各チューブを4℃、4000×gで10min 遠心した
+
:: ↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
:: ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
:: ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
:: ↓遠心後、上清を捨てた
:: ↓遠心後、上清を捨てた
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:: ↓沈殿にR3を4mLを加えてVortexを行った
+
:: ↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
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:: ↓L7を4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置した
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:: ↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
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:: ↓N3を4mLを加えた
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:: ↓N3 4mLを加えた
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:: ↓室温、12,000×gで10min遠心した
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:: ↓室温、12,000rpmで10min遠心した
:: ↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
:: ↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
:: ↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
:: ↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
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:(6) pSB1A2の大量培養→培養完了
:(6) pSB1A2の大量培養→培養完了
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:(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミディプレ→電気泳動で確認
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:(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ
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::*写真参照
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::  →吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。
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【考察】
【考察】
:(1) BBa-K193602は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかった
:(1) BBa-K193602は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかった

Revision as of 05:38, 16 September 2010

August 18

【時間】

9:00~

【実験担当】

岩城、古道、竹内、中村

【実験名】

(1) BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のストリーク
(2) BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク
(3) コンピタントセルの調整(17日の続き)
(4) l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(5) pSB3K3、pSB6のプレカルチャー(前日の大量培養がコンタミした為)
(6) pSB1A2の大量培養
(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ

【実験目的】

(1) BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のシングルコロニーを得る
(2) BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る
(3) 作成したコンピタントセルの形質転換率の確認
(4) l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
(5) 19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する
(6) pSB1A2の大量培養
(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ

【実験内容】

(1) BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)のストリーク
 BBa-K193602(melA)、BBa-K121013(GFP on pBS6)をLBプレート(+amp)にストリークした
 ↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
(2) BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク
 BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート(+amp)にストリークした
 ↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
(3) コンピタントセルの調整
 前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
 ↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
 ↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
 ↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた
 ↓O.D=0.4~0.8になるように調節した
(4) l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)のトランスフォーメーション
 l13522[2-(8A)]、R0040(1-6I)をDH5αにトランスフォーメーションした
 ↓37℃でインキュベート(Overnight)
(5) pSB3K3、pSB6のプレカルチャー
 pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
 ↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Km)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
(6) pSB1A2の大量培養
 前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及びpSB1C3を、それぞれLB培地(+amp)30mL、LB培地(+クロラムフェニコーム)に大量培養
(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ
 大量培養させておいたpSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)をそれぞれ50mLチューブに15~25mL程分注した
 ↓比重計で、それぞれ等量を量った
 ↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
 ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
 ↓遠心後、上清を捨てた
 ↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
 ↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
 ↓N3 4mLを加えた
 ↓室温、12,000rpmで10min遠心した
 ↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
 ↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×2)
 ↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
*以降の操作は翌日に繰り越した

【実験結果】

19日に確認を行った結果を以下に示す
(1) BBa-K121013に関しては、シングルコロニーが得られたが、BBa-K193602はシングルコロニーが得られなかった
(2) BBa-1732019、BBa-1732950を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
(3) 次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
(4) R0040(1-6I)、I13522[2-(8A)]をトランスフォーメーション後、培養した結果、
前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
(5) pSB3K3、pSB6のプレカルチャー→培養完了
(6) pSB1A2の大量培養→培養完了
(7) pSB1C3(提出用ベクター)、pSB1A2(GFP on pSB1)のミニプレ
  →吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。

【考察】

(1) BBa-K193602は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかった
これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったと考えられる
(2) BBa-1732019、BBa-1732950についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
(4) R0040(1-6I)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる
I13522[2-(8A)]に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある