Template:KIT-Kyoto-Augsut18

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:9:00～
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【実験担当】
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'''Member'''
:岩城、古道、竹内、中村
:岩城、古道、竹内、中村
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:Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura
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【実験名】
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'''Purpose'''
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:(1)　BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）のストリーク
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:# Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
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:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のストリーク
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:# Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
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:(3)　コンピタントセルの調整（17日の続き）
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:# Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
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:(4)　l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）のトランスフォーメーション
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:# Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
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:(5)　pSB3K3、pSB6のプレカルチャー（←前日の大量培養がコンタミした為）
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:# Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
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:(6)　pSB1A2の大量培養
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:# Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
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:(7)　pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ
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:# DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]
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:(1)　pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る　[中村]
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:(2)　pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る　[中村,革島]
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:(3)　作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認　[古道]
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:(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]
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:(5)　19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する　[岩城]
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:(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養　[革島]
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:(7)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ　[竹内]
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【実験目的】
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'''Method'''
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:(1)　BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）のシングルコロニーを得る
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:(1)　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク
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:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950のシングルコロニーを得る
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::　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート（+amp）にストリーク
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:(3)　作成したコンピタントセルの形質転換率の確認
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::　↓37℃でインキュベート（Overnight）
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:(4)　l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）のトランスフォーメーション
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:(5)　19日以降、pSB3K3、pSB6を大量培養する
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:(6)　pSB1A2の大量培養
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:(7)　pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ
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【実験内容】
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:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク
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:(1)　BBa-K193602（melA）、BBa-K121013（GFP on pBS6）をLBプレート（+amp）にストリーク
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::　pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート（+amp）にストリーク
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::↓37℃でインキュベートした（Overnight）
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::　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
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:(2)　BBa-1732019、BBa-1732950をLBプレート（+amp）にストリーク
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:(3)コンピタントセルの調整（17日の続き）
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::↓37℃でインキュベートした（Overnight）
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::　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
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::　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
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::　↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
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::　↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた
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::　↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した
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:(3)　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
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:(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション
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::↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
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::　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした
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::↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
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::　↓37℃でインキュベート(Overnight)
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::↓吸光度測定した（＊実際は牛島さんに測っていただいた）
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:(4)　l13522[2-(8A)]、R0040（1-6I）をDH5αにトランスフォーメーションした
 
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::↓37℃でインキュベートした（Overnight）
 
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:(5)　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
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:(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー
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::↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地（l）（+Km）、LB培地（l）（+amp）に植え継ぎ、37℃で振とう培養した
+
::　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
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::　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
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:(6)　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2及び、pSB1C3を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋ｸﾛﾗﾑﾌｪﾆｺｰﾑ）に大量培養した
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:(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養
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::　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋Cam）に大量培養
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:(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミディプレ
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::　大量培養させておいたpSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
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::　↓比重計で、それぞれ等量を量った
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::　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
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::　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
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::　↓遠心後、上清を捨てた
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::　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
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::　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
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::　↓N3 4mLを加えた
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::　↓室温、12,000rpmで10min遠心した
 +
::　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
 +
::　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)
 +
::　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
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:(7)　大量培養させておいたpSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
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:＊以降の操作は翌日に繰り越した
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::↓比重計で、それぞれ等量を量った
+
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::↓各チューブを4℃、4000×gで10min遠心した
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::↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
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::↓遠心後、上清を捨てた
+
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::↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
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::↓L7 4mLを加え、やさしく混合し、5min室温放置した
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::↓N3 4mLを加えた
+
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::↓室温、12,000×gで10min遠心した
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::↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
+
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::↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した（×２）
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::↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
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'''Result'''
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:19日に確認を行った結果を以下に示す
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:＊以降の操作は翌日に繰り越した
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:(1)　psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった
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:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
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:(3)　次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
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:(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、
 +
::前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
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:(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了
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:(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了
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:(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミニプレ
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::　　→吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。
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'''Consideration'''
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:(1)　pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。
 +
::これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる
 +
 
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:(2)　pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
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:(3)翌日、吸光度を測定する
 +
 
 +
:(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。
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::pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。

Latest revision as of 10:26, 25 October 2010

August 18

>>top

Time

9:00～

Member

岩城、古道、竹内、中村
Iwaki,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

  1. Picking up single colony of pSB4A5(K193602) and pSB6A1(K121013).[Nakamura]
  2. Picking up single colony of pSB1A2(I732019、I732950).[Nakamura,Kawashima]
  3. Checking CFU of competent cells made yesterday.[Furumichi]
  4. Transform pSB1A2(I13522) and pSB1A2(R0040) into the competent cells. [Nakamura]
  5. Cultivate pSB3K3(J04450) and pSB6A1(J04450).[Iwaki]
  6. Cultivate pSB1A2(E0240) and pSB1C3(J04450).[Kawashima]
  7. DNA miniprep of pSB1C3(J04450) and pSB1A2(E0240).[Takauchi]
(1)　pSB4A5(K193602)、pAB6A1(K121013)のシングルコロニーを得る　[中村]
(2)　pSB1A2(I732019、I732950)のシングルコロニーを得る　[中村,革島]
(3)　作成したコンピタントセルの形質転換効率の確認　[古道]
(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(R0040)のトランスフォーメーション　[中村]
(5)　19日以降、pSB3K3(J04450),pSB6A1(J04450)を大量培養する　[岩城]
(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養　[革島]
(7)　pSB1C3(J04450)、pSB1A2(E0240)のミニプレ　[竹内]

Method

(1)　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)のストリーク
　pSB4A5(K193602),pSB6A1(K121013)をLBプレート（+amp）にストリーク
　↓37℃でインキュベート（Overnight）
(2)　pSB1A2(I732019,I732950)のストリーク
　pSB1A2(I732019,I732950)をLBプレート（+amp）にストリーク
　↓37℃でインキュベートを行った(Overnight)
(3)コンピタントセルの調整（17日の続き）
　前日のDH5αのプレートから、シングルコロニーをピックアップした
　↓SOB培地 2mLに植え継ぎ、37℃、300rpmで6h 振とう培養した
　↓その後、SOC培地 250mLにDH5α全量を入れ、18℃、250rpmで振とう培養した
　↓しばらく時間をおいて濁度を測定し、様子をみた
　↓O.D＝0.4～0.8になるように調節した
(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)のトランスフォーメーション
　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をDH5αにトランスフォーメーションした
　↓37℃でインキュベート(Overnight)


(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー
　pSB3K3、pSB6のプレートから共に2番のシングルコロニーをピックアップした
　↓pSB3K3、pSB6をそれぞれLB培地(l)(+Kan)、LB培地(l)(+amp)に植え継ぎ、37℃で振とう培養
(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養
　前日2mLで振とう培養していたpSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)を、それぞれLB培地（+amp）30mL、LB培地（＋Cam）に大量培養
(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミディプレ
　大量培養させておいたpSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
　↓比重計で、それぞれ等量を量った
　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
　↓遠心後、上清を捨てた
　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
　↓N3 4mLを加えた
　↓室温、12,000rpmで10min遠心した
　↓上清を保存し、先程、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
　↓カラムの上にW8 10mLを加え、洗浄した(×２)
　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4 5mLを加え、DNAを洗浄した
＊以降の操作は翌日に繰り越した

Result

19日に確認を行った結果を以下に示す
(1)　psB6A1(K121013)に関しては、シングルコロニーが得られたが、pSB4A5(K193602)はシングルコロニーが得られなかった
(2)　pSB1A2(I732019,I732950)を培養した結果、シングルコロニーが得られなかった
(3)　次の日に吸光度を測定するそれまでしばらく培養させておいた
(4)　pSB1A2(I13522)、pSB1A2(Roo40)をトランスフォーメーション後、培養した結果、
前者は全く生えず、後者は生えたがコロニーに異常が見られた
(5)　pSB3K3(J04450)、pSB6A1(J04450)のプレカルチャー→培養完了
(6)　pSB1A2(E0240),pSB1C3(J04450)の大量培養→培養完了
(7)　pSB1C3（J04450）、pSB1A2（E0240）のミニプレ
　　→吸光度測定で十分な濃度であることが確認できた。

Consideration

(1)　pSB4A5(K193602)は生え過ぎの為、シングルコロニーが得られなかったと考えられる。
これはストリークの際、菌液を十分に薄くしながら撒けなかったためと考えられる
(2)　pSB1A2(I732019,I732950)についても生え過ぎていた為、(1)と同じ原因であると考えられる
(3)翌日、吸光度を測定する
(4) pSB1A2(Roo40)が生えなかった理由として、白金耳の熱により菌が死滅してしまっていた事が考えられる。
pSB1A2(I13522)に関しては、理由は不明であるが、コンタミした可能性がある。
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