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From 2010.igem.org

August 17

【時間】

9:00～17:00

【実験担当】

岩城,福山,古道,革島,吉村

【実験目的】

(1)　pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック

(2)　pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ

(3)　コンピテントセル(DH5α)の調整

(4)　DH5α(pSB1A2(12-M),pSB1A3(3-A))のシングルコロニーのピックアップ

【実験内容】

(1)　pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック

　pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のシングルコロニーをピックアップし、

　それぞれ以下の条件で6時間ほど振とう培養を行った

　　　pSB1A2(12-M)→LB(+amp)(2ml)

　　　pSB1C3(3-A)→LB(+クロラムフェニコール)(2ml)

　↓それぞれにアルカリミニプレップを行った

　↓次の条件で制限酵素処理を行った

　　　ミリQ　11μl

　　　Hバッファー　2μl

　　　DNA(pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A))　5μl

　　　制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ)　各1μl

　↓37℃で1時間インキュベートを行った

　↓電気泳動を行った

(2)　pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ

　大量培養しておいたpSB3K3(Low copy vector),pSB6A1(Low copy vector)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した

　↓比重計で、それぞれ等量を量った

　↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した

　↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした

　↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した

　↓N3 4mLを加えた

　↓室温、12,000rpmで10分間遠心した

　↓上清を保存し、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた

　↓カラムの上にW8を10mL加え、洗浄した(×２)

　↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4を5mL加え、DNAを洗浄した

　↓E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanolを3.5mL加えた

　↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓70% ethanolを3mL加えた

　↓15,000rpm、4℃で5分間遠心した　

　↓遠心後、上清を捨てた

　↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥させた

　↓TEを50μL加え、溶け切るまで冷蔵した

　↓この吸光度を計測した

(3)　コンピテントセル(DH5α)の調整

　DH5αをLBプレート(抗生物質の入ってない)に播いた

　↓37℃で一晩インキュベートした

(4)　DH5α(pSB1A2(12-M),pSB1A3(3-A))のシングルコロニーのピックアップ

　プレートにはえたDH5α(pSB1A2(12-M)),DH5α(pSB1A3(3-A))のコロニーを、

　それぞれ3つずつピックアップしてアンピシリン入りのLB液体培地で

　1コロニーにつき培地3mlの条件で6時間ほど振とう培養した

【実験結果】

(1)　バンドがはっきり見えたので、これらを大量培養する

(2)　吸光度の結果

	pSB6A1	pSB3K3
1回目	1.132	0.155
2回目	0.994	0.138
3回目	0.984	0.126
4回目	0.990	0.122
5回目	0.975	0.125
平均	1.015	0.1332

これよりpsB6A1のプラスミドの濃度は5075ng/μLである

この結果より、十分な量のプラスミド抽出ができたことを確認した

これよりpSB3K3　のプラスミドの濃度は666 ng/μLである

この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した

(3)　後日、十分な数のコロニーを確認した

(4)　培養できていた→カットチェック