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Template:KIT-Kyoto-Augsut17
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| + | 【実験担当】 | ||
| + | :岩城,福山,古道,革島,吉村 | ||
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| + | 【実験目的】 | ||
| + | :(1) pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック | ||
| + | :(2) pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ | ||
| + | :(3) コンピテントセル(DH5α)の調整 | ||
| + | :(4) DH5α(pSB1A2(12-M),pSB1A3(3-A))のシングルコロニーのピックアップ | ||
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| + | 【実験内容】 | ||
| + | :(1) pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック | ||
| + | :: pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のシングルコロニーをピックアップし、 | ||
| + | :: それぞれ以下の条件で6時間ほど振とう培養を行った | ||
| + | :: pSB1A2(12-M)→LB(+amp)(2ml) | ||
| + | :: pSB1C3(3-A)→LB(+クロラムフェニコール)(2ml) | ||
| + | :: ↓それぞれにアルカリミニプレップを行った | ||
| + | :: ↓次の条件で制限酵素処理を行った | ||
| + | :: ミリQ 11μl | ||
| + | :: Hバッファー 2μl | ||
| + | :: DNA(pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)) 5μl | ||
| + | :: 制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ) 各1μl | ||
| + | :: ↓37℃で1時間インキュベートを行った | ||
| + | :: ↓電気泳動を行った | ||
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| + | :(2) pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ | ||
| + | :: 大量培養しておいたpSB3K3(Low copy vector),pSB6A1(Low copy vector)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した | ||
| + | :: ↓比重計で、それぞれ等量を量った | ||
| + | :: ↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した | ||
| + | :: ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した | ||
| + | :: ↓遠心後、上清を捨てた | ||
| + | :: ↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした | ||
| + | :: ↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した | ||
| + | :: ↓N3 4mLを加えた | ||
| + | :: ↓室温、12,000rpmで10分間遠心した | ||
| + | :: ↓上清を保存し、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた | ||
| + | :: ↓カラムの上にW8を10mL加え、洗浄した(×２) | ||
| + | :: ↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4を5mL加え、DNAを洗浄した | ||
| + | :: ↓E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanolを3.5mL加えた | ||
| + | :: ↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した | ||
| + | :: ↓遠心後、上清を捨てた | ||
| + | :: ↓70% ethanolを3mL加えた | ||
| + | :: ↓15,000rpm、4℃で5分間遠心した | ||
| + | :: ↓遠心後、上清を捨てた | ||
| + | :: ↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥させた | ||
| + | :: ↓TEを50μL加え、溶け切るまで冷蔵した | ||
| + | :: ↓この吸光度を計測した | ||
| + | |||
| + | :(3) コンピテントセル(DH5α)の調整 | ||
| + | :: DH5αをLBプレート(抗生物質の入ってない)に播いた | ||
| + | :: ↓37℃で一晩インキュベートした | ||
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| + | :(4) DH5α(pSB1A2(12-M),pSB1A3(3-A))のシングルコロニーのピックアップ | ||
| + | :: プレートにはえたDH5α(pSB1A2(12-M)),DH5α(pSB1A3(3-A))のコロニーを、 | ||
| + | :: それぞれ3つずつピックアップしてアンピシリン入りのLB液体培地で | ||
| + | :: 1コロニーにつき培地3mlの条件で6時間ほど振とう培養した | ||
| + | |||
| + | 【実験結果】 | ||
| + | :(1) バンドがはっきり見えたので、これらを大量培養する | ||
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| + | :(2) 吸光度の結果 | ||
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| + | ::これよりpsB6A1のプラスミドの濃度は5075ng/μLである | ||
| + | ::この結果より、十分な量のプラスミド抽出ができたことを確認した | ||
| + | |||
| + | ::これよりpSB3K3 のプラスミドの濃度は666 ng/μLである | ||
| + | ::この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した | ||
| + | |||
| + | :(3) 後日、十分な数のコロニーを確認した | ||
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| + | :(4) 培養できていた→カットチェック | ||
Revision as of 05:28, 16 September 2010
August 17
【時間】
- 9:00～17:00
【実験担当】
- 岩城,福山,古道,革島,吉村
【実験目的】
- (1) pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック
- (2) pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ
- (3) コンピテントセル(DH5α)の調整
- (4) DH5α(pSB1A2(12-M),pSB1A3(3-A))のシングルコロニーのピックアップ
【実験内容】
- (1) pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のカットチェック
- pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)のシングルコロニーをピックアップし、
- それぞれ以下の条件で6時間ほど振とう培養を行った
- pSB1A2(12-M)→LB(+amp)(2ml)
- pSB1C3(3-A)→LB(+クロラムフェニコール)(2ml)
- ↓それぞれにアルカリミニプレップを行った
- ↓次の条件で制限酵素処理を行った
- ミリQ 11μl
- Hバッファー 2μl
- DNA(pSB1A2(12-M),pSB1C3(3-A)) 5μl
- 制限酵素(EcoRⅠ,PstⅠ) 各1μl
- ↓37℃で1時間インキュベートを行った
- ↓電気泳動を行った
- (2) pSB3K3,pSB6Aのミディプレップ
- 大量培養しておいたpSB3K3(Low copy vector),pSB6A1(Low copy vector)をそれぞれ50mLチューブに15～25mL程分注した
- ↓比重計で、それぞれ等量を量った
- ↓各チューブを4℃、4000rpmで10分間遠心した
- ↓この間、カラムにEQ1 10mLを加え、カラムを平衡化した
- ↓遠心後、上清を捨てた
- ↓沈殿にR3 4mLを加えて、Vortexした
- ↓L7 4mLを加え、ゆっくり混合し、5分間室温放置した
- ↓N3 4mLを加えた
- ↓室温、12,000rpmで10分間遠心した
- ↓上清を保存し、平衡化させておいたカラムの上に全量加えた
- ↓カラムの上にW8を10mL加え、洗浄した(×２)
- ↓カラムの下に15mLチューブを設置し、E4を5mL加え、DNAを洗浄した
- ↓E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanolを3.5mL加えた
- ↓15,000rpm、4℃で30分間遠心した
- ↓遠心後、上清を捨てた
- ↓70% ethanolを3mL加えた
- ↓15,000rpm、4℃で5分間遠心した
- ↓遠心後、上清を捨てた
- ↓37℃でインキュベートし、適度に乾燥させた
- ↓TEを50μL加え、溶け切るまで冷蔵した
- ↓この吸光度を計測した
- (3) コンピテントセル(DH5α)の調整
- DH5αをLBプレート(抗生物質の入ってない)に播いた
- ↓37℃で一晩インキュベートした
- (4) DH5α(pSB1A2(12-M),pSB1A3(3-A))のシングルコロニーのピックアップ
- プレートにはえたDH5α(pSB1A2(12-M)),DH5α(pSB1A3(3-A))のコロニーを、
- それぞれ3つずつピックアップしてアンピシリン入りのLB液体培地で
- 1コロニーにつき培地3mlの条件で6時間ほど振とう培養した
【実験結果】
- (1) バンドがはっきり見えたので、これらを大量培養する
- (2) 吸光度の結果
pSB6A1 pSB3K3 1回目 1.132 0.155 2回目 0.994 0.138 3回目 0.984 0.126 4回目 0.990 0.122 5回目 0.975 0.125 平均 1.015 0.1332
- これよりpsB6A1のプラスミドの濃度は5075ng/μLである
- この結果より、十分な量のプラスミド抽出ができたことを確認した
- これよりpSB3K3 のプラスミドの濃度は666 ng/μLである
- この結果より、使用できる量のプラスミドが抽出できたことを確認した
- (3) 後日、十分な数のコロニーを確認した
- (4) 培養できていた→カットチェック
