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From 2010.igem.org

August 16

【時間】

9:00～17:00

【実験担当】

岩城,福山,竹内,臼井,足立,中村,革島

【実験名】

(1)　pSB3K3,pSB6A1のプレカルチャー

(2)　pSB1A2(12-M)及びpSB1C3(3-A)のトランスフォーメーション

(3)　SodA,ProxyR,AcrABのプライマー設計・注文

【実験目的】

(1)　pSB3K3,pSB6A1の大量培養をする

(2)　目的のインサートを持たないpSB1A2(1-B)を増やしていたため、

pSB1A2(12-M)をトランスフォーメーションしなおす

また、パーツ登録時に必要なpSB1C3(3-A)のトランスフォーメーションをする

(3)過酸化水素応答プロモーターをPCR処理によって得るためのプライマーを設計する

【実験内容】

(1)　pSB3K3,pSB6A1のプレカルチャー

　プレート培地上のコロニーからpSB3K3・pSB6A1をピックアップし、

　各2本ずつ、それぞれYT培地30ml(+kan)・YT培地30ml(+amp)を使用し、37℃,overnightで振とう培養した

(2)　pSB1A2(12-M)及びpSB1C3(3-A)のトランスフォーメーション

　DH5αを on ice 10分

　↓pSB1A2(12-M)及びpSB1C3(3-A)をそれぞれ1μLずつ加え、on ice 30min.

　↓42℃,45sec.でヒートショックを行った

　↓on ice 2min.

　↓37℃に温めたSOC培地0.9mLを加え、37℃シェーカーで1時間振とう培養を行った

　↓培養した菌液全量をプレートにまいた

　↓37℃でインキュベートした(Overnight)

(3)　SodA,ProxyR,AcrABのプライマー設計・注文

過酸化水素応答プロモーター配列をiGEM推奨のサイトGinkgo Bioworksを用いて編集し、プライマーを設計した

【実験結果】

(1)　プラスミドを抽出するのに十分な増殖が肉眼で確認できた

(2)　コロニーが生えた

(3)　後日、AcrABはPCR処理で上手く得ることができたが、

SodA,ProxyRに関してはPCR処理でうまく得ることができなかった

これはプライマー設計時に何かしらの間違いがあったものと考えられるが詳細はいまだ不明