"

From 2010.igem.org

August 15

【時間】

9:00～18:00

【実験担当】

坂田（15:00∼）,臼井,革島,中村,吉村

【実験名】

(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ

(2)pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動

(3)1％アガロースゲルの作成

【実験目的】

(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ

(2)pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する

(3)1％アガロースゲルの作成

【実験内容】

(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ

培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った

↓4℃、15,000rpm、5min遠心

↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した

↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した

↓5min on ice

↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した

↓5min on ice

↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

↓4℃、15,000rpm、20min遠心した

↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

↓上澄みを捨てた

↓30sec　遠心乾燥した

RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした

(2)pSB1のカットチェック

＜組成＞

pSB1A2	5μL
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
Buffer(H)	1μL
H2O	11μL
計	20μL

pSB3K3	5μL
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
Buffer(H)	1μL
H2O	11μL
計	20μL

これを1h,37℃でインキュベートした

↓Loading Buffer　1μLを加えたものと、

　マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gel のコームに流し込んだ

↓100V,30min泳動した

↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した

泳動結果を写真で撮影した

【実験結果】

(2)pSB1A2

→4つ中2番にバンドが確認された。

　　2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。

(3)pSB3K3

→4つ中1，2番の2本にバンドが確認された。

　　LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した。