Template:KIT-Kyoto-Augsut15

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Revision as of 11:01, 3 October 2010

August 15

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Time

9:00～18:00

Member

坂田(15:00∼),臼井,革島,中村,吉村

Sakata,Usui,Kawashima,Nakamura,Yoshimura

Purpose

(1)　pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ

(2)　pSB1A2(J44000)及びpSB3K3(J04450)が大腸菌に挿入されているかどうか制限酵素処理によって確認する

Method

(1)　pSB3K3(J04450)のアルカリミニプレップ

　培養後のpSB3K3(J04450)を1.5mLエッペンチューブに取った

　↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpm、20min遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30sec　遠心乾燥した

　↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした

(2)pSB1A2(J44000)及びpSB3K3(J04450)のカットチェック

＜組成＞
pSB1A2	5μL	pSB3K3	5μL
EcoRⅠ	1μL	EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL	PstⅠ	1μL
Buffer(H)	1μL	Buffer(H)	1μL
H₂O	11μL	H2O	11μL
計	20μL	計	20μL

　これを1h,37℃でインキュベートした

　↓Loading Buffer　1μLを加えたものと、

　　マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gelのコームに流し込んだ

　↓100V,30min泳動した

　↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した

　↓泳動結果を写真で撮影した

Results

(1)　抽出したプラスミドを冷蔵保存した

(2)　pSB1A2

　→4つ中2番にバンドが確認された。

　　　2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した

(3)　pSB3K3

　→4つ中1，2番の2本にバンドが確認された

　　　LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した

Consideration

(1)　翌日、制限酵素処理によって目的プラスミドの挿入を確認する

(2)　翌日以降、培養を続けプラスミドを大量に回収する

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