Template:KIT-Kyoto-Augsut15

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Revision as of 02:45, 14 September 2010

August 15

【時間】

9:00~18:00

【実験担当】

坂田(15:00∼),臼井,革島,中村,吉村

【実験名】

(1) pSB3K3のアルカリミニプレップ
(2) pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動
(3) 1%アガロースゲルの作成

【実験目的】

(1) pSB3K3のアルカリミニプレップ
(2) pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する
(3) 1%アガロースゲルの作成

【実験内容】

(1) pSB3K3のアルカリミニプレップ
 培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った
 ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
 ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
 ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
 ↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した
 ↓5min on ice
 ↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した
 ↓5min on ice
 ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
 ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
 ↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
 ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
 ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
 ↓上澄みを捨てた
 ↓30sec 遠心乾燥した
 ↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
(2)pSB1のカットチェック
<組成>
pSB1A25μLpSB3K35μL
EcoRⅠ1μLEcoRⅠ1μL
PstⅠ1μLPstⅠ1μL
Buffer(H)1μLBuffer(H)1μL
H2O11μLH2O11μL
20μL20μL
 これを1h,37℃でインキュベートした
 ↓Loading Buffer 1μLを加えたものと、
 ↓マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gel のコームに流し込んだ
 ↓100V,30min泳動した
 ↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した
 ↓泳動結果を写真で撮影した

【実験結果】

(2) pSB1A2
 →4つ中2番にバンドが確認された。
   2番(プレカルチャーしておいたもの)にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。
(3) pSB3K3
 →4つ中1,2番の2本にバンドが確認された。
   LB培地(kan+)2mLを加え、振とう培養した。