Template:KIT-Kyoto-Augsut15

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Revision as of 11:49, 9 September 2010

August 15

【時間】

9:00～18:00

【実験担当】

坂田（15:00∼）,臼井,革島,中村,吉村

【実験名】

(1)　pSB3K3のアルカリミニプレップ

(2)　pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動

(3)　1％アガロースゲルの作成

【実験目的】

(1)　pSB3K3のアルカリミニプレップ

(2)　pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する

(3)　1％アガロースゲルの作成

【実験内容】

(1)　pSB3K3のアルカリミニプレップ

　培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った

　↓4℃、15,000rpm、5min遠心

　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた

　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した

　↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した

　↓5min on ice

　↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した

　↓5min on ice

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　↓4℃、15,000rpm、20min遠心した

　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

　↓上澄みを捨てた

　↓30sec　遠心乾燥した

　↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした

(2)pSB1のカットチェック

＜組成＞

pSB1A2	5μL
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
Buffer(H)	1μL
H2O	11μL
計	20μL

pSB3K3	5μL
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
Buffer(H)	1μL
H2O	11μL
計	20μL

　これを1h,37℃でインキュベートした

　↓Loading Buffer　1μLを加えたものと、

　↓マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gel のコームに流し込んだ

　↓100V,30min泳動した

　↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した

　↓泳動結果を写真で撮影した

【実験結果】

(2)　pSB1A2

　→4つ中2番にバンドが確認された。

　　　2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。

(3)　pSB3K3

　→4つ中1，2番の2本にバンドが確認された。

　　　LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した。

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 【実験名】
-:(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
+:(1)　pSB3K3のアルカリミニプレップ
-:(2)pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動
+:(2)　pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動
-:(3)1％アガロースゲルの作成
+:(3)　1％アガロースゲルの作成
 【実験目的】
-:(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
+:(1)　pSB3K3のアルカリミニプレップ
-:(2)pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する
+:(2)　pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する
-:(3)1％アガロースゲルの作成
+:(3)　1％アガロースゲルの作成
 【実験内容】
-:(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
+:(1)　pSB3K3のアルカリミニプレップ
-::培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った
+::　培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った
-::↓4℃、15,000rpm、5min遠心
+::　↓4℃、15,000rpm、5min遠心
-::↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
+::　↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
-::↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
+::　↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
-::↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した
+::　↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した
-::↓5min on ice
+::　↓5min on ice
-::↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した
+::　↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した
-::↓5min on ice
+::　↓5min on ice
-::↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
+::　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
-::↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
+::　↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
-::↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
+::　↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
-::↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
+::　↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
-::↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)
+::　↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)
-::↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
+::　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
-::↓上澄みを捨てた
+::　↓上澄みを捨てた
-::↓30sec　遠心乾燥した
+::　↓30sec　遠心乾燥した
-::RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
+::　↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
 :(2)pSB1のカットチェック
 :＜組成＞
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-::これを1h,37℃でインキュベートした
-::↓Loading Buffer　1μLを加えたものと、
-::　マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gel のコームに流し込んだ
-::↓100V,30min泳動した
-::↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した
-::泳動結果を写真で撮影した
 【実験結果】
-:(2)pSB1A2
+:(2)　pSB1A2
-::→4つ中2番にバンドが確認された。
+::　→4つ中2番にバンドが確認された。
-::　　2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。
+::　　　2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。
-:(3)pSB3K3
+:(3)　pSB3K3
-::→4つ中1，2番の2本にバンドが確認された。
+::　→4つ中1，2番の2本にバンドが確認された。
-::　　LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した。
+::　　　LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した。