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Template:KIT-Kyoto-Augsut15
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Revision as of 08:37, 9 September 2010
August 15
【時間】
- 9:00～18:00
【実験担当】
- 坂田（15:00∼）,臼井,革島,中村,吉村
【実験名】
- (1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
- (2)pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動
- (3)1％アガロースゲルの作成
【実験目的】
- (1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
- (2)pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する
- (3)1％アガロースゲルの作成
【実験内容】
- (1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
- 培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った
- ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
- ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
- ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
- ↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した
- ↓5min on ice
- ↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した
- ↓5min on ice
- ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
- ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
- ↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
- ↓70％EtOHを1mL加えた(vortex)
- ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
- ↓上澄みを捨てた
- ↓30sec 遠心乾燥した
- RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
- (2)pSB1のカットチェック
- ＜組成＞
pSB1A2 5μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL Buffer(H) 1μL H2O 11μL 計 20μL
pSB3K3 5μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL Buffer(H) 1μL H2O 11μL 計 20μL - これを1h,37℃でインキュベートした
- ↓Loading Buffer 1μLを加えたものと、
- マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gel のコームに流し込んだ
- ↓100V,30min泳動した
- ↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した
- 泳動結果を写真で撮影した
【実験結果】
- (2)pSB1A2
- →4つ中2番にバンドが確認された。
- 2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。
- (3)pSB3K3
- →4つ中1，2番の2本にバンドが確認された。
- LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した。
