Template:KIT-Kyoto-Augsut15

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Revision as of 07:56, 9 September 2010

August 15

【時間】

9:00～18:00

【実験担当】

坂田（15:00∼）,臼井,革島,中村,吉村

【実験名】

(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ

(2)pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動

(3)1％アガロースゲルの作成

【実験目的】

(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ

(2)pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する

(3)1％アガロースゲルの作成

【実験内容】

(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ

培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った

　 ↓4℃、15,000rpm、5min遠心

上澄みをデカンテーションで取り除いた

　　↓

菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した

　　↓

SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した

　　↓5min on ice

SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した

　　↓5min on ice

4℃、15,000rpm、10min遠心した

　　↓

上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した

　　↓

等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた

　　↓4℃、15,000rpm、20min遠心した

70％EtOHを1mL加えた(vortex)

　　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した

上澄みを捨てた

　↓30sec　遠心乾燥した

RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした

(2)pSB1のカットチェック

＜組成＞

pSB1A2	5μL
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
Buffer(H)	1μL
H2O	11μL
計	20μL

pSB3K3	5μL
EcoRⅠ	1μL
PstⅠ	1μL
Buffer(H)	1μL
H2O	11μL
計	20μL

これを1h,37℃でインキュベートした

　　　　　　　　↓

Loading Buffer　1μLを加えたものと、マーカー(1kbp radder)を

1% Agarose Gel のコームに流し込んだ

　　　　　　　　↓100V,30min泳動した

　　　　　　　　↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した

泳動結果を写真で撮影した

【実験結果】

(2)pSB1A2

　　→4つ中2番にバンドが確認された。

　　　2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。

(3)pSB3K3

　　→4つ中1，2番の2本にバンドが確認された。

　　　LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した。

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 == August 15 ==
-【時間】　9:00～18:00
+【時間】
-【実験担当】坂田（15:00∼）,臼井,革島,中村,吉村
+:9:00～18:00
+【実験担当】
+:坂田（15:00∼）,臼井,革島,中村,吉村
 【実験名】
 :(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
 :(2)pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動
 :(3)1％アガロースゲルの作成
 【実験目的】
 :(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
 :(2)pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する
 :(3)1％アガロースゲルの作成
 【実験内容】
-:（1）pSB3K3のアルカリミニプレップ
+:(1)pSB3K3のアルカリミニプレップ
-:培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った
+::培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った
-:　 ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
+::　 ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
-:上澄みをデカンテーションで取り除いた
+::上澄みをデカンテーションで取り除いた
-:　　↓
+::　　↓
-:菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
+::菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
-:　　↓
+::　　↓
-:SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した
+::SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した
-:　　↓5min on ice
+::　　↓5min on ice
-:SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した
+::SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した
-:　　↓5min on ice
+::　　↓5min on ice
-:4℃、15,000rpm、10min遠心した
+::4℃、15,000rpm、10min遠心した
-:　　↓
+::　　↓
-:上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
+::上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
-:　　↓
+::　　↓
-:等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
+::等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
-:　　↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
+::　　↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
-:70％EtOHを1mL加えた(vortex)
+::70％EtOHを1mL加えた(vortex)
-:　　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
+::　　↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
-:上澄みを捨てた
+::上澄みを捨てた
-:　↓30sec　遠心乾燥した
+::　↓30sec　遠心乾燥した
-:RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
+::RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
-:
+::
-:（2）pSB1のカットチェック
+:(2)pSB1のカットチェック
-::〈組成〉
+:＜組成＞
-::pSB1A2	5μL
+:<TABLE BORDER="1" CELLPADDING="3">
-::EcoRⅠ	1μL
+:<TR>
-::PstⅠ	        1μL
+:<TD>pSB1A2</TD><TD>5μL</TD></TR>
-::Buffer(H) 	1μL
+:<TR>
-::H2O   	11μL
+:<TD>EcoRⅠ</TD><TD>1μL</TD></TR>
-:: 計   	20μL
+:<TR>
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+:<TD>H2O</TD><TD>11μL</TD></TR>
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+:<TD>計</TD><TD>20μL</TD></TR>
+:</TABLE>
-::pSB3K3	5μL
+:<TABLE BORDER="1" CELLPADDING="3">
-::EcoRⅠ	1μL
+:<TR>
-::PstⅠ 	1μL
+:<TD>pSB3K3</TD><TD>5μL</TD></TR>
-::Buffer(H)	1μL
+:<TR>
-::H2O   	11μL
+:<TD>EcoRⅠ</TD><TD>1μL</TD></TR>
-:: 計   	20μL
+:<TR>
+:<TD>PstⅠ</TD><TD>1μL</TD></TR>
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+:<TR>
+:<TD>H2O</TD><TD>11μL</TD></TR>
+:<TR>
+:<TD>計</TD><TD>20μL</TD></TR>
+:</TABLE>
+::これを1h,37℃でインキュベートした
+::　　　　　　　　↓
+:: Loading Buffer　1μLを加えたものと、マーカー(1kbp radder)を
+::1% Agarose Gel のコームに流し込んだ
+::　　　　　　　　↓100V,30min泳動した
+::　　　　　　　　↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した
+::泳動結果を写真で撮影した
-:これを1h,37℃でインキュベートした
-:　　　　　　　　↓
-: Loading Buffer　1μLを加えたものと、マーカー(1kbp radder)を
-:1% Agarose Gel のコームに流し込んだ
-:　　　　　　　　↓100V,30min泳動した
-:　　　　　　　　↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した
-:泳動結果を写真で撮影した
 【実験結果】
-:（2）pSB1A2
+:(2)pSB1A2
 :　　→4つ中2番にバンドが確認された。
 :　　　2番（プレカルチャーしておいたもの）にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。
-:（3）pSB3K3
+:(3)pSB3K3
 :　　→4つ中1，2番の2本にバンドが確認された。
 :　　　LB培地（kan+）2mLを加え、振とう培養した。