Template:KIT-Kyoto-Augsut15
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- | :(2) | + | :(2) pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する |
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【実験内容】 | 【実験内容】 | ||
- | :(1) | + | :(1) pSB3K3のアルカリミニプレップ |
- | :: | + | :: 培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った |
- | :: | + | :: ↓4℃、15,000rpm、5min遠心 |
- | :: | + | :: ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた |
- | :: | + | :: ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した |
- | :: | + | :: ↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した |
- | :: | + | :: ↓5min on ice |
- | :: | + | :: ↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した |
- | :: | + | :: ↓5min on ice |
- | :: | + | :: ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した |
- | :: | + | :: ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した |
- | :: | + | :: ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた |
- | :: | + | :: ↓4℃、15,000rpm、20min遠心した |
- | :: | + | :: ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex) |
- | :: | + | :: ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した |
- | :: | + | :: ↓上澄みを捨てた |
- | :: | + | :: ↓30sec 遠心乾燥した |
- | :: | + | :: ↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした |
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- | + | :: これを1h,37℃でインキュベートした | |
- | + | :: ↓Loading Buffer 1μLを加えたものと、 | |
- | + | :: ↓マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gel のコームに流し込んだ | |
- | + | :: ↓100V,30min泳動した | |
- | + | :: ↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した | |
- | + | :: ↓泳動結果を写真で撮影した | |
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【実験結果】 | 【実験結果】 | ||
- | :(2) | + | :(2) pSB1A2 |
- | :: | + | :: →4つ中2番にバンドが確認された。 |
- | :: | + | :: 2番(プレカルチャーしておいたもの)にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。 |
- | :(3) | + | :(3) pSB3K3 |
- | :: | + | :: →4つ中1,2番の2本にバンドが確認された。 |
- | :: | + | :: LB培地(kan+)2mLを加え、振とう培養した。 |
Revision as of 11:49, 9 September 2010
August 15
【時間】
- 9:00~18:00
【実験担当】
- 坂田(15:00∼),臼井,革島,中村,吉村
【実験名】
- (1) pSB3K3のアルカリミニプレップ
- (2) pSB1及びpSB3K3の制限酵素処理及び電気泳動
- (3) 1%アガロースゲルの作成
【実験目的】
- (1) pSB3K3のアルカリミニプレップ
- (2) pSB1及びpSB3K3が正しく制限酵素処理されているかどうかを確認する
- (3) 1%アガロースゲルの作成
【実験内容】
- (1) pSB3K3のアルカリミニプレップ
- 培養後のpSB3K3を1.5mLエッペンチューブに取った
- ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
- ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
- ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)した
- ↓SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)した
- ↓5min on ice
- ↓SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)した
- ↓5min on ice
- ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
- ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
- ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
- ↓4℃、15,000rpm、20min遠心した
- ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
- ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
- ↓上澄みを捨てた
- ↓30sec 遠心乾燥した
- ↓RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにした
- (2)pSB1のカットチェック
- <組成>
pSB1A2 5μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL Buffer(H) 1μL H2O 11μL 計 20μL pSB3K3 5μL EcoRⅠ 1μL PstⅠ 1μL Buffer(H) 1μL H2O 11μL 計 20μL
- これを1h,37℃でインキュベートした
- ↓Loading Buffer 1μLを加えたものと、
- ↓マーカー(1kbp radder)を1% Agarose Gel のコームに流し込んだ
- ↓100V,30min泳動した
- ↓EtBr(10mg/mL)で20min染色した
- ↓泳動結果を写真で撮影した
【実験結果】
- (2) pSB1A2
- →4つ中2番にバンドが確認された。
- 2番(プレカルチャーしておいたもの)にLB培地(amp+)2mLを加え、振とう培養した。
- (3) pSB3K3
- →4つ中1,2番の2本にバンドが確認された。
- LB培地(kan+)2mLを加え、振とう培養した。