Template:KIT-Kyoto-Augsut13

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August 13

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Time

9:00~21:00

Member

岩城,竹内,中村,吉村,足立
Iwaki,Takeuchi,Nakamura,Yoshimura,Adachi


Purpose

  1. pSB3K3 transformed into the competent cells(DH5Alpha) convincingly onto a LB(+kan) plate.
  2. Miniprep pSB1A2(J44000),pSB6A1(J04450) from 12/8
  3. Digested these and Ran on a Gel
  • pSB1A2(J44000)
  • pSB6A1(J04450)
(1) 12日にLB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする
(2) 前日に培養したpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のプラスミド抽出
(3) DH5αに目的プラスミドpSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)が挿入されているか制限酵素処理をすることによって確かめる

Method

(1) pSB3K3(J04450)のトランスフォーメーション
 -80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した
 ↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した
 ↓on ice 30min
 ↓45℃で45sec、過熱した
 ↓on ice 2min
 ↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
 ↓37℃で1h、振とう培養した
 ↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
(2) pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)のミニプレップ
 培養後のpSB1A2(J44000)とpSB6A1(J04450)を1.5mLチューブに取った
 ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した
 ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた
 ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)
 ↓SolutionⅡ200μLを加え混合した(vortex不可)
 ↓5min on ice
 ↓SolutionⅢ150μLを加え混合した(vortex)
 ↓5min on ice
 ↓4℃、15,000rpm、10min遠心した
 ↓上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移した
 ↓等量(400μL)イソプロピルアルコールを加えた
 ↓4℃、15,000rpmで20分間遠心した
 ↓70%EtOHを1mL加えた(vortex)
 ↓4℃、15,000rpm、10分間遠心した
 ↓上澄みを捨てた
 ↓30秒間遠心乾燥を行った
 ↓RNase in TEを30μL加えてプラスミドDNAにした
(3) pSB1A2(J44000)及びpSB6A1(J04450)の制限酵素処理と電気泳動
pSB1A2(J44000)pSB6A1(J04450)
XbaⅠ,Pst1μL-
EcoRⅠ,Spe-1μL
(2)で得たpSB1A2
プラスミド
5μL-
(2)で得たpSB6A1
プラスミド
-5μL
H2O11μL11μL
H Buffer1μL2μL
M Buffer1μL-
20μL20μL
右の組成で1.5mlチューブ内で混合した
37℃で1時間インキュベートした
↓Loading Bufferを1μLそれぞれに加え、コームに流した
 (マーカーは1kbp radderを使用した)
↓100Vで30分間電気泳動し、EtBr(10mg/mL)で染色した
↓泳動結果を写真で撮影した

Result

(1)  2つのコロニーの生育を確認した(ピンク)
(2,3) pSB6A1(J04450)→2本のバンドが確認できたことにより、目的プラスミドの挿入が確認できた
 pSB1A2(J44000)→バンドが検出できなかった

Consideration

(1)
(2,3) 翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る
 翌日、再度カットしなおして電気泳動を行う