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From 2010.igem.org

August 13

【時間】

9:00～21:00

【実験担当】

岩城,竹内,中村,吉村,足立

【実験名】

(1)　pSB3K3のトランスフォーメーション

(2)　pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ

(3)　pSB1A2,pSB6A1の電気泳動

【実験目的】

(1)　LB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーションをする

(2)　pSB1A2及びpSB6A1のプラスミド抽出

(3)　DH5αにプラスミドpSB1A2及びpSB6A1が挿入されているかのチェック

【実験内容】

(1)　pSB3K3のトランスフォーメーション

　-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解した

　↓DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを1.5mLエッペンに混合した

　↓on　ice　30min

　↓45℃で45sec、ヒートショックを行った

　↓on　ice　2min

　↓各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた

　↓37℃で1h、振とう培養した

　↓培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight

(2)　pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ

培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mLチューブに取った ↓4℃、15,000rpmで5分間遠心した ↓上澄みをデカンテーションで取り除いた ↓菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁した(vortex)

　　↓

SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)

　　↓5min on ice

SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)

　　↓5min on ice

4℃、15,000rpm、10min遠心

　　↓

上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す

　　↓

等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える

　　↓4℃、15,000rpm、20min遠心

70％EtOHを1mL加える(vortex)

　　↓4℃、15,000rpm、10min遠心

上澄みを捨てる

　↓30sec　遠心乾燥

RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする

(3) ＜組成1＞pSB1A2 　XbaⅠ,PstⅠ・・・・1μL

　(2)で得られたpSB1A2プラスミド・・・5μL

　H2O・・・・・・・・11μL

　H Buffer・・・・・・1μL

　M Buffer・・・・・・1μL

計20μL

＜組成2＞pSB6A1 　EcoRⅠ,ScaⅠ・・・・1μL

　(2)で得られたpSB6A1プラスミド・・・5μL

　H2O・・・・・・・・11μL

　H Buffer・・・・・・2μL

計20μL

1h,37℃でインキュベート

　　　　　　　　↓

Loading Buffer　1μLをそれぞれに加えコームに流した

(マーカーは1kbp radderを使用した)

　　　　　　　　↓

100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色

　　　　　　　　↓

泳動結果を写真で撮影した

【実験結果】 (1)コロニーが２つだけ確認(ピンク)。(3)pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた。翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る。 　　pSB1A2→Bandが現れなかった。翌日、再度カットしなおして電気泳動する。