Template:KIT-Kyoto-Augsut13

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Augsut 13

【時間】 9:00~21:00

【実験担当】岩城,竹内,中村,吉村,足立

【実験名】

(1)pSB3K3のトランスフォーメーション
(2)pSB1A2,pSB6A1のアルカリミニプレップ
(3)pSB1A2,pSB6A1の電気泳動

【実験目的】

(1)LB(+amp)で間違えて培養していたため、LB(+kan)で再度pSB3K3のトランスフォーメーション をする
(2)pSB1A2及びpSB6A1のプラスミド抽出
(3)DH5αにプラスミドpSB1A2及びpSB6A1が挿入されているかのチェック

【実験内容】

(1)-80℃で保存していたコンピタントセル(DH5α)を氷上で溶解
          ↓
  DH5α100μLに対し、pSB3K3 1μLを、1.5mLエッペンに混合
          ↓
  on ice 30min
          ↓
  45℃で45sec、ヒートショック
          ↓
  on ice 2min
          ↓
  各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
          ↓
  37℃で1h、振とう培養
          ↓
  培養後、全量をLBプレート(+kan)に撒き、37℃でOvernight
(2)培養後のpSB1A2とpSB6A1を1.5mL
  ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
上澄みをデカンテーションで取り除く
  ↓
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
  ↓
SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)
  ↓5min on ice
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
  ↓5min on ice
4℃、15,000rpm、10min遠心
  ↓
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す
  ↓
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える
  ↓4℃、15,000rpm、20min遠心
70%EtOHを1mL加える(vortex)
  ↓4℃、15,000rpm、10min遠心
上澄みを捨てる
 ↓30sec 遠心乾燥
RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする
(3)
<組成1>pSB1A2
 XbaⅠ,PstⅠ・・・・1μL
 (2)で得られたpSB1A2プラスミド・・・5μL
 H2O・・・・・・・・11μL
 H Buffer・・・・・・1μL
 M Buffer・・・・・・1μL
計20μL
<組成2>pSB6A1
 EcoRⅠ,ScaⅠ・・・・1μL
 (2)で得られたpSB6A1プラスミド・・・5μL
 H2O・・・・・・・・11μL
 H Buffer・・・・・・2μL
計20μL
1h,37℃でインキュベート

        ↓

Loading Buffer 1μLをそれぞれに加えコームに流した
(マーカーは1kbp radderを使用した)
        ↓
100V,30min電気泳動しEtBr(10mg/mL)で染色
        ↓
泳動結果を写真で撮影した

【実験結果】

(1)コロニーが2つだけ確認(ピンク)。
(3)pSB6A1→Bandが確認、挿入が確かめられた。翌日から組み換え大腸菌の大量培養に入る。
  pSB1A2→Bandが現れなかった。翌日、再度カットしなおして電気泳動する。