Team:LMU-Munich/Cut'N'survive/Schedule

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Contents

Aim 1: DNA replication+PCR

For PCR key see PCR key Colourcode for the primers: Annealing part, mutagenised part, other sequences integrated into primer

PCR1: replication of the Tet-inducible CMV promotor [X] PCR1.jpg

Primer used: 1TreF 2TreR

PCR2a: replication of the TEVrecogn-NDegron-SF3 Part with mutagenisis (EcoR1 + Pst1) [ ] PCR2a.jpg

Primer used: 3TevF 4TevMutEPR

PCR2b: replication of the TEVrecogn-NDegron-SF3 Part with mutagenisis (EcoR1 + Pst1) [ ] PCR2b.jpg

Primer used: 5TevMutEPF 6TevR

PCR3: joining PCR of the TEVrecogn-NDegron-SF3 Part [ ] PCR3.jpg

Primer used: 3TevF 6TevR

PCR4a: replication human bak with mutagenisis (Pst1) [ ] PCR4a.jpg

Primer used: 7BakF 8BakMutPR

PCR4b: replication human bak with mutagenisis (Pst1) [ ] PCR4b.jpg

Primer used: 9BakMutPF 10BakR

PCR5: joining PCR of human bak [ ] PCR5.jpg

Primer used: 7BakF 10BakR

PCR6: replication of the SV40-polyadenylation site [X] PCR6.jpg

Primer used: 11PAF 12PAR

PCR7a: replication of the p14*TEVrecogn with mutagenisis (Spe1) [ ] PCR7a.jpg

Primer used: 13TrecF 14TrecMutSR

PCR7b: replication of the p14*TEVrecogn with mutagenisis (Spe1) with TEV recogn in primer (16TrecR) [ ] PCR7b.jpg

Primer used: 15TrecMutSF 16TrecR

PCR8: joining PCR of p14*TEVrecogn with TEV recogn in primer (16TrecR) [ ] PCR8.jpg

Primer used: 13TrecF 16TrecR

Aim 2: Assembling Biobricks

Aim 3: Testing products

Aim 4: Testing system

oder

Aim 1: DNA reproduction+PCR

Aim 2: Assembling Biobricks

Aim 3: Testing products

Aim 4: Testing system


alt:

Meilensteine

Für die Projekte haben wir uns jeweils folgende „Meilensteine“ gesetzt:

„TEV-System“

1. Verknüpfen von Bak mit interagierendem Protein A, einem N-Degron und einer Schnittstelle für die TEV-Protesase, sodass Bak noch aktiv bleibt. Davor ist ein induzierbarer Promotor und eine Antibiotikaresistenz geschaltet (Nachweis: induzierbarer Zelltod) Aufwand: ca. 6-8 Wochen, 2000€

2. Verknüpfen von eGFP als Zielgen mit einer TEV-Schnittstelle, einer TEV-Protease, und interagierendem Protein B. (Nachweis: eGFP leuchtet, Proteinchromatographie)

Aufwand: ca. 6-8 Wochen, 2000€, Parallele Arbeit ist möglich und notwendig

3. Einbringen beider Konstrukte in Zellen (Nachweis: eGFP leuchtet, einige Zellen sterben, Proteinchromatographie)

Aufwand: ca. 2 Wochen, 1000€

4. Parallel wird versucht, das erste Konstrukt stabil ins Zellgenom einzubauen.

Aufwand: ca. 2 Wochen, 500€