Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September24

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*Arac+RBS+pSB1A3保有株のminiprep
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*Miniprep of Arac+RBS+pSB1A3
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*miniprep後のサンプル泳動
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*Follow quality check
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== Arac+RBS+pSB1A3保有株のminiprep ==
+
== Miniprep of Arac+RBS+pSB1A3  ==
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#昨日懸濁しておいた菌を1 mLずつ1.5 mLチューブ2本に分注した。
+
#Transfered E.coli solution to 1.5 mL tubes, 1 mL each
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#4C,15000rpm,1minで遠心した。
+
#Centrifuged at 4C, 15000rpm for 1min
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#上澄みを捨て、4Cで保存しておいたBuffer P1をそれぞれ125 uLずつ入れ、Voltexで撹拌した。
+
#Discarded the supernatant
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#Buffer N3を175 uLずつ入れ、すぐに転倒混和した。
+
#Suspended on 125 uL of Buffer P1 each
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#4C,13000rpm,10min遠心した。
+
#Added 175 uL Buffer N3 each mixed by inversion
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#上澄みをデカントでカラムに移し、4C,13000rpm,1minで遠心した。
+
#Centrifuged at 4C, 13000rpm for 10min
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#下澄み液を捨て、500 uLのBuffer PBを添加して、4C,13000rpm,1minで遠心した。
+
#Transfered the supernatant to filtration column
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#下澄みを捨て、さらに1min遠心した。
+
#Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
-
#新しい1.5 mLチューブにカラムを移し、TEを50 uL入れ1min放置した後、1min遠心した。
+
#Discarded the flow-through
 +
#added 500 uL of Buffer PB to filtration column
 +
#Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
 +
#Discarded the flow-through centrifuged for 1min to remove remaining buffer
 +
#Transfered filtration column to a new 1.5 ml tube
 +
#Resuspended on 50 ul of TE and incubated at RT for 1min
 +
#Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min

Revision as of 12:45, 21 October 2010

Notebook
  • Miniprep of Arac+RBS+pSB1A3
  • Follow quality check

Miniprep of Arac+RBS+pSB1A3

  1. Transfered E.coli solution to 1.5 mL tubes, 1 mL each
  2. Centrifuged at 4C, 15000rpm for 1min
  3. Discarded the supernatant
  4. Suspended on 125 uL of Buffer P1 each
  5. Added 175 uL Buffer N3 each mixed by inversion
  6. Centrifuged at 4C, 13000rpm for 10min
  7. Transfered the supernatant to filtration column
  8. Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
  9. Discarded the flow-through
  10. added 500 uL of Buffer PB to filtration column
  11. Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min
  12. Discarded the flow-through centrifuged for 1min to remove remaining buffer
  13. Transfered filtration column to a new 1.5 ml tube
  14. Resuspended on 50 ul of TE and incubated at RT for 1min
  15. Centrifuged at 4C, 13000rpm for 1min


miniprep後のサンプル泳動

１　uLのサンプルとloading　buffer1 uL混ぜ、6 uLのλ/Hind Ⅲ　EcoRⅠとともに泳動した。


HokkaidoU Japan 20100924a.JPG


マーカーとの比較からこのプラスミドは7000bp位の大きさだと思われる。

Arabinose Promoter+RBS+pSB1A3のbp数が3455bpなので、パーツ及びベクターを2個ずつ含むプラスミドであると考えられる。

この写真から、プラスミド溶液の濃度は30　ng/uL と推定した。






plasmidとGFP+double terminatorのdigestion

以下の組成で試薬を調整した。

Reagent Amount
DW 5.6 uL
10x H　Buffer 1 uL
0.1% BSA 1 uL
Spe I 0.2 uL
Pst I 0.2 uL
plasmid 2 uL
Total 10 uL
Reagent Amount
DW 34 uL
10x M　Buffer 5 uL
0.1% BSA 5 uL
Xba I 4 uL
Pst I 0.4 uL
GFP+double terminator 1.6 uL
Total 50 uL













  1. 37C,1hour置いた。
  2. Mycrocon YM-10を使って切れ端の除去を行う。sampleが500 uLになるようにTEを加え、カラムに移した。
  3. 4C,14000g,1hour遠心した。
  4. 上澄みが30 uL前後残ったので、それを新しいcollection tubeに移し、カラムを逆さまにして挿入した。
  5. 4C,1000g,3min遠心した。
  6. GFP+double terminatorが30 uL、plasmid25 uL回収できたので、各1/10量の3M CH3COONaを加えた。
  7. 100%EtOHを回収量の2.5倍量加え、voltexにかけた。
  8. 4C,15000rpm,10min遠心した。
  9. 上澄みを捨て、70%EtOHを500 uL加え、voltexにかけた。
  10. 4C,15000rpm,5min遠心した。
  11. 上澄みを捨て、真空装置へ入れよく乾燥させた。
  12. 2 uLのTEで溶かした。
  13. -20Cで凍結保存した。


Transformation of BAC Vector

  • Used DH5Alpha and MG1655 strains for electroporation
  • Plated at 19:15
  • Will be incubated for 18 h
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