Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September21

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Revision as of 18:02, 27 October 2010

Notebook


Annealing of RBS made from oligos

Construction of RBS (BBa_B0034) from oligos. Already precut!

Annealing of RBS (BBa_B0034) made from oligos

For this I ordered oligo primers for sigma




アラビノース依存型GFP発現装置の作成　

パーツ情報

  • GFP-doubleterminator

BBa_I13401 1-12K 875bp pSB1A2

  • アラビノースプロモーター

BBa_I0050 3-20B 1210bp pSB2K3

  • pSB1C3 2072bp
  • pSB1A3 2157bp


1)アラビノースプロモーター、GFP、pSB1A3を以下の組成で調整した。

Reagent Amount
Dw 33 uL
10×PCR buffur 5
2mM 4dNTP 5
MgSO4 3
Ex-F 1
Ps-R 1
KOD neo plus 1
DNA 1
Total 50 uL

2)

94C　2min

98C　10sec

68C 2min

35cycle

4C hold

という設定でPCRした。


3)PCR後、10 ulのローディングバッファーを各サンプルに入れて1レーンにつき12 ul入れ泳動した。


4)サンプルをゲルから抽出し、promegaのキットを用いて精製した。


5)精製したサンプルを1 ul取り、1 ulのローディングバッファーを加えた後、6 ulのλ/Hind Ⅲ　EcoRⅠとともに泳動した。

泳動結果


左から

1.λ/Hind Ⅲ　EcoRⅠ

2.アラビノースプロモーター

3.GFP+double terminator

4.pSB1A3

5.RFP reporter

6.RFP?

7.Heat shock promoter
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