Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September21

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For this I ordered oligo primers for sigma
For this I ordered oligo primers for sigma
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-
== アラビノース依存型GFP発現装置の作成 ==
+
== Arabinose induced expression of GFP  ==
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パーツ情報
+
*GFP-doubleterminator
*GFP-doubleterminator
BBa_I13401 1-12K 875bp pSB1A2
BBa_I13401 1-12K 875bp pSB1A2
-
*アラビノースプロモーター
+
*Arabinose promoter
BBa_I0050 3-20B 1210bp pSB2K3
BBa_I0050 3-20B 1210bp pSB2K3
*pSB1C3 2072bp
*pSB1C3 2072bp
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-
1)アラビノースプロモーター、GFP、pSB1A3を以下の組成で調整した。
+
1)PCR mix of Arabinose promoter and GFP, pSB1A3
-
{|style="text-align:center; float:left;" class="protocol"
+
{|style="text-align:center; margin-left:100px;" class="protocol"  
!Reagent
!Reagent
!Amount
!Amount
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|style="border-top:1px solid #996;"|'''50 uL'''
|style="border-top:1px solid #996;"|'''50 uL'''
|}
|}
-
 
2)
2)
-
94C 2min
+
* 94C 2min
-
98C 10sec
+
* 98C 10sec
-
68C 2min
+
* 68C 2min
-
35cycle
+
** 35cycle
-
4C hold
+
* 4C hold
-
という設定でPCRした。
+
 
 +
3)After PCR, Electrophored and extracted samples
 +
 
 +
4)Estimated the concentration of the samples
 +
 
 +
<div style="margin-left:100px;">
 +
[[Image:HokkaidoU_Japan_20100921a.JPG‎|200px|thumb|left|泳動結果]]
 +
 
 +
 
 +
from left to right
 +
 
 +
1.λ/Hind III, EcoR I
 +
 
 +
2.Arabinose promoter
 +
 
 +
3.GFP+double terminator
-
3)PCR後、10 ulのローディングバッファーを各サンプルに入れて1レーンにつき12 ul入れ泳動した。
+
4.pSB1A3
-
4)サンプルをゲルから抽出し、promegaのキットを用いて精製した。
+
5.RFP reporter
-
5)精製したサンプルを1 ul取り、1 ulのローディングバッファーを加えた後、6 ulのλ/Hind Ⅲ EcoRⅠとともに泳動した。
+
6.RFP?
-
[[Image:HokkaidoU_Japan_20100921a.JPG‎|200px|right|thumb|]]
+
7.Heat shock promoter</div>

Latest revision as of 02:35, 28 October 2010


Annealing of RBS made from oligos

Construction of RBS (BBa_B0034) from oligos. Already precut!

Annealing of RBS (BBa_B0034) made from oligos

For this I ordered oligo primers for sigma




Arabinose induced expression of GFP  

  • GFP-doubleterminator

BBa_I13401 1-12K 875bp pSB1A2

  • Arabinose promoter

BBa_I0050 3-20B 1210bp pSB2K3

  • pSB1C3 2072bp
  • pSB1A3 2157bp


1)PCR mix of Arabinose promoter and GFP, pSB1A3

Reagent Amount
Dw 33 uL
10×PCR buffur 5
2mM 4dNTP 5
MgSO4 3
Ex-F 1
Ps-R 1
KOD neo plus 1
DNA 1
Total 50 uL

2)

  • 94C 2min
  • 98C 10sec
  • 68C 2min
    • 35cycle
  • 4C hold

3)After PCR, Electrophored and extracted samples

4)Estimated the concentration of the samples

泳動結果


from left to right

1.λ/Hind III, EcoR I

2.Arabinose promoter

3.GFP+double terminator

4.pSB1A3

5.RFP reporter

6.RFP?

7.Heat shock promoter