pSB1C3, araC Promoter, GFPの制限酵素処理～Transformation

Digestion

pSB1C3は9月6日にPCR後のゲル抽したDNA(2256 ng/uL)を20倍に希釈して使用した．

10x M buffer	5 uL
DW	34
pSB1C3	1
BSA	5
EcoR I	2
Pst I	3
Total	50 uL

10x M buffer	5 uL
DW	27
Promoter	8
BSA	5
EcoR I	3
Spe I	2
Total	50 uL

10x M buffer	5 uL
DW	32
GFP	3
BSA	5
Xba I	4
Pst I	1
Total	50 uL

→37℃で2時間培養
→それぞれにSample Buffer 10 uLを加えて電気泳動

• pSB1C3はバンドが確認できなかった

→ほかの2つはゲル抽して回収

• 40 uLになった

エタ沈

• 上のDNA solution 40 uLに4 uLの3M 酢酸ナトリウムを加えた
• 44 uLの100% EtOHを加え，ドライアイスで凍結させた
• 解凍15,000rpm@4℃で5分間遠心した
• 上清を捨て，100 uLの70% EtOHでリンスし，同じく遠心
• 上清を捨て，乾燥させて，それぞれ2 uLのTEで溶かした

promoter: 125 ng/2uL，GFP: 106 ng/2uLになっているはず

• pSB1C3は9月6日にEPcut，エタ沈したものを電気泳動して濃度を確かめた
• 20 ng/uLくらい

→2 uL使う

Ligation

pSB1C3	2 uL
promoter	2 uL
GFP	2 uL
Mighty Mix	6 uL
T4 ligase	0.4 uL
Total	12.4 uL'

このうち5 uLは先生がエレクトロポレーションに使用．残りを50 uLコンピにTransformation