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Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September14
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{|style="text-align:center; float:left;" class="protocol" | {|style="text-align:center; float:left;" class="protocol" | ||
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| - | |style="border-top:1px solid # | + | |style="border-top:1px solid #996;"|'''Total''' |
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* 上のDNA solution 40 uLに4 uLの3M 酢酸ナトリウムを加えた | * 上のDNA solution 40 uLに4 uLの3M 酢酸ナトリウムを加えた | ||
* 44 uLの100% EtOHを加え，ドライアイスで凍結させた | * 44 uLの100% EtOHを加え，ドライアイスで凍結させた | ||
| - | * 解凍15, | + | * 解凍15,996rpm@4℃で5分間遠心した |
* 上清を捨て，100 uLの70% EtOHでリンスし，同じく遠心 | * 上清を捨て，100 uLの70% EtOHでリンスし，同じく遠心 | ||
* 上清を捨て，乾燥させて，それぞれ2 uLのTEで溶かした | * 上清を捨て，乾燥させて，それぞれ2 uLのTEで溶かした | ||
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|0.4 uL | |0.4 uL | ||
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このうち5 uLは先生がエレクトロポレーションに使用．残りを50 uLコンピに[[Transformation]] | このうち5 uLは先生がエレクトロポレーションに使用．残りを50 uLコンピに[[Transformation]] | ||
Revision as of 07:09, 20 September 2010
since 13 Jul 2010
since 1 Aug 2010
pSB1C3, araC Promoter, GFPの制限酵素処理～Transformation
Digestion
pSB1C3は9月6日にPCR後のゲル抽したDNA(2256 ng/uL)を20倍に希釈して使用した．
| Reagent | Amount |
|---|---|
| 10x M buffer | 5 uL |
| DW | 34 |
| pSB1C3 | 1 |
| BSA | 5 |
| EcoR I | 2 |
| Pst I | 3 |
| Total | 50 uL |
| Reagent | Amount |
|---|---|
| 10x M buffer | 5 uL |
| DW | 27 |
| Promoter | 8 |
| BSA | 5 |
| EcoR I | 3 |
| Spe I | 2 |
| Total | 50 uL |
| Reagent | Amount |
|---|---|
| 10x M buffer | 5 uL |
| DW | 32 |
| GFP | 3 |
| BSA | 5 |
| Xba I | 4 |
| Pst I | 1 |
| Total | 50 uL |
→37℃で2時間培養
→それぞれにSample Buffer 10 uLを加えて電気泳動
- pSB1C3はバンドが確認できなかった
→ほかの2つはゲル抽して回収
- 40 uLになった
エタ沈
- 上のDNA solution 40 uLに4 uLの3M 酢酸ナトリウムを加えた
- 44 uLの100% EtOHを加え，ドライアイスで凍結させた
- 解凍15,996rpm@4℃で5分間遠心した
- 上清を捨て，100 uLの70% EtOHでリンスし，同じく遠心
- 上清を捨て，乾燥させて，それぞれ2 uLのTEで溶かした
promoter: 125 ng/2uL，GFP: 106 ng/2uLになっているはず
- pSB1C3は9月6日にEPcut，エタ沈したものを電気泳動して濃度を確かめた
- 20 ng/uLくらい
→2 uL使う
Ligation
| Reagent | Amount |
|---|---|
| pSB1C3 | 2 uL |
| promoter | 2 uL |
| GFP | 2 uL |
| Mighty Mix | 6 uL |
| T4 ligase | 0.4 uL |
| Total | 12.4 uL' |
