Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September14
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(→Digestion) |
(→Ligation) |
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==Ligation== | ==Ligation== | ||
{|style="text-align:center;" class="protocol" | {|style="text-align:center;" class="protocol" | ||
+ | !Reagent | ||
+ | !Amount | ||
|- | |- | ||
|pSB1C3 | |pSB1C3 |
Revision as of 06:49, 20 September 2010
pSB1C3, araC Promoter, GFPの制限酵素処理~Transformation
Digestion
pSB1C3は9月6日にPCR後のゲル抽したDNA(2256 ng/uL)を20倍に希釈して使用した.
Reagent | Amount |
---|---|
10x M buffer | 5 uL |
DW | 34 |
pSB1C3 | 1 |
BSA | 5 |
EcoR I | 2 |
Pst I | 3 |
Total | 50 uL |
Reagent | Amount |
---|---|
10x M buffer | 5 uL |
DW | 27 |
Promoter | 8 |
BSA | 5 |
EcoR I | 3 |
Spe I | 2 |
Total | 50 uL |
Reagent | Amount |
---|---|
10x M buffer | 5 uL |
DW | 32 |
GFP | 3 |
BSA | 5 |
Xba I | 4 |
Pst I | 1 |
Total | 50 uL |
→37℃で2時間培養
→それぞれにSample Buffer 10 uLを加えて電気泳動
- pSB1C3はバンドが確認できなかった
→ほかの2つはゲル抽して回収
- 40 uLになった
エタ沈
- 上のDNA solution 40 uLに4 uLの3M 酢酸ナトリウムを加えた
- 44 uLの100% EtOHを加え,ドライアイスで凍結させた
- 解凍15,000rpm@4℃で5分間遠心した
- 上清を捨て,100 uLの70% EtOHでリンスし,同じく遠心
- 上清を捨て,乾燥させて,それぞれ2 uLのTEで溶かした
promoter: 125 ng/2uL,GFP: 106 ng/2uLになっているはず
- pSB1C3は9月6日にEPcut,エタ沈したものを電気泳動して濃度を確かめた
- 20 ng/uLくらい
→2 uL使う
Ligation
Reagent | Amount |
---|---|
pSB1C3 | 2 uL |
promoter | 2 uL |
GFP | 2 uL |
Mighty Mix | 6 uL |
T4 ligase | 0.4 uL |
Total | 12.4 uL' |