Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September14

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pSB1C3は9月6日にPCR後のゲル抽したDNA(2256 ng/uL)を20倍に希釈して使用した．
pSB1C3は9月6日にPCR後のゲル抽したDNA(2256 ng/uL)を20倍に希釈して使用した．
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|10x M buffer
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==Ligation==
==Ligation==
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|pSB1C3
|pSB1C3

Revision as of 06:53, 19 September 2010

Notebook

pSB1C3, araC Promoter, GFPの制限酵素処理～Transformation

Digestion

HokkaidoU Japan 20100914a.jpg

pSB1C3は9月6日にPCR後のゲル抽したDNA(2256 ng/uL)を20倍に希釈して使用した．

10x M buffer 5 uL
DW 34
pSB1C3 1
BSA 5
EcoR I 2
Pst I 3
Total 50 uL
10x M buffer 5 uL
DW 27
Promoter 8
BSA 5
EcoR I 3
Spe I 2
Total 50 uL
10x M buffer 5 uL
DW 32
GFP 3
BSA 5
Xba I 4
Pst I 1
Total 50 uL

→37℃で2時間培養
→それぞれにSample Buffer 10 uLを加えて電気泳動

  • pSB1C3はバンドが確認できなかった

→ほかの2つはゲル抽して回収

  • 40 uLになった


エタ沈

HokkaidoU Japan 20100914b.jpg
  • 上のDNA solution 40 uLに4 uLの3M 酢酸ナトリウムを加えた
  • 44 uLの100% EtOHを加え，ドライアイスで凍結させた
  • 解凍15,000rpm@4℃で5分間遠心した
  • 上清を捨て，100 uLの70% EtOHでリンスし，同じく遠心
  • 上清を捨て，乾燥させて，それぞれ2 uLのTEで溶かした

promoter: 125 ng/2uL，GFP: 106 ng/2uLになっているはず

  • pSB1C3は9月6日にEPcut，エタ沈したものを電気泳動して濃度を確かめた
  • 20 ng/uLくらい

→2 uL使う


Ligation

pSB1C3 2 uL
promoter 2 uL
GFP 2 uL
Mighty Mix 6 uL
T4 ligase 0.4 uL
Total 12.4 uL'
このうち5 uLは先生がエレクトロポレーションに使用．残りを50 uLコンピにTransformation
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