Team:HokkaidoU Japan/Notebook/September14

From 2010.igem.org

(Difference between revisions)
(New page: {{Template:HokkaidoU_Japan}})
Line 1: Line 1:
{{Template:HokkaidoU_Japan}}
{{Template:HokkaidoU_Japan}}
 +
=pSB1C3, araC Promoter, GFPの制限酵素処理～Transformation=
 +
==Digestion==
 +
[[Image:HokkaidoU Japan 20100914a.jpg‎|200px|right|thumb|]]
 +
pSB1C3は9月6日にPCR後のゲル抽したDNA(2256 ng/uL)を20倍に希釈して使用した．
 +
{|style="text-align:center; float:left; margin-left:50px;"
 +
|-
 +
|10x M buffer
 +
|5 uL
 +
|-
 +
|DW
 +
|34
 +
|-
 +
|pSB1C3
 +
|1
 +
|-
 +
|BSA
 +
|5
 +
|-
 +
|EcoR I
 +
|2
 +
|-
 +
|Pst I
 +
|3
 +
|-
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''Total'''
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''50 uL'''
 +
|}
 +
{|style="text-align:center; float:left; margin-left:50px;"
 +
|-
 +
|10x M buffer
 +
|5 uL
 +
|-
 +
|DW
 +
|27
 +
|-
 +
|Promoter
 +
|8
 +
|-
 +
|BSA
 +
|5
 +
|-
 +
|EcoR I
 +
|3
 +
|-
 +
|Spe I
 +
|2
 +
|-
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''Total'''
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''50 uL'''
 +
|}
 +
{|style="text-align:center; float:left; margin-left:50px;"
 +
|-
 +
|10x M buffer
 +
|5 uL
 +
|-
 +
|DW
 +
|32
 +
|-
 +
|GFP
 +
|3
 +
|-
 +
|BSA
 +
|5
 +
|-
 +
|Xba I
 +
|4
 +
|-
 +
|Pst I
 +
|1
 +
|-
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''Total'''
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''50 uL'''
 +
|}
 +
 +
<div style="clear:both"></div>
 +
→37℃で'''2時間'''培養<br>
 +
→それぞれにSample Buffer 10 uLを加えて電気泳動
 +
* pSB1C3はバンドが確認できなかった
 +
→ほかの2つはゲル抽して回収
 +
* 40 uLになった
 +
 +
 +
==エタ沈==
 +
[[Image:HokkaidoU Japan 20100914b.jpg‎|200px|right|thumb|]]
 +
* 上のDNA solution 40 uLに4 uLの3M 酢酸ナトリウムを加えた
 +
* 44 uLの100% EtOHを加え，ドライアイスで凍結させた
 +
* 解凍15,000rpm@4℃で5分間遠心した
 +
* 上清を捨て，100 uLの70% EtOHでリンスし，同じく遠心
 +
* 上清を捨て，乾燥させて，それぞれ2 uLのTEで溶かした
 +
 +
promoter: 125 ng/2uL，GFP: 106 ng/2uLになっているはず
 +
* pSB1C3は9月6日にEPcut，エタ沈したものを電気泳動して濃度を確かめた
 +
* 20 ng/uLくらい
 +
→2 uL使う
 +
 +
 +
==Ligation==
 +
{|style="text-align:center;"|
 +
|-
 +
|pSB1C3
 +
|2 uL
 +
|-
 +
|promoter
 +
|2 uL
 +
|-
 +
|GFP
 +
|2 uL
 +
|-
 +
|Mighty Mix
 +
|6 uL
 +
|-
 +
|T4 ligase
 +
|0.4 uL
 +
|-
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''Total'''
 +
|style="border-top:1px solid #000;"|'''12.4 uL'
 +
|}
 +
 +
このうち5 uLは先生がエレクトロポレーションに使用．残りを50 uLコンピに[[Transformation]]

Revision as of 13:00, 18 September 2010

pSB1C3, araC Promoter, GFPの制限酵素処理～Transformation

Digestion

HokkaidoU Japan 20100914a.jpg

pSB1C3は9月6日にPCR後のゲル抽したDNA(2256 ng/uL)を20倍に希釈して使用した．

10x M buffer 5 uL
DW 34
pSB1C3 1
BSA 5
EcoR I 2
Pst I 3
Total 50 uL
10x M buffer 5 uL
DW 27
Promoter 8
BSA 5
EcoR I 3
Spe I 2
Total 50 uL
10x M buffer 5 uL
DW 32
GFP 3
BSA 5
Xba I 4
Pst I 1
Total 50 uL

→37℃で2時間培養
→それぞれにSample Buffer 10 uLを加えて電気泳動

  • pSB1C3はバンドが確認できなかった

→ほかの2つはゲル抽して回収

  • 40 uLになった


エタ沈

HokkaidoU Japan 20100914b.jpg
  • 上のDNA solution 40 uLに4 uLの3M 酢酸ナトリウムを加えた
  • 44 uLの100% EtOHを加え，ドライアイスで凍結させた
  • 解凍15,000rpm@4℃で5分間遠心した
  • 上清を捨て，100 uLの70% EtOHでリンスし，同じく遠心
  • 上清を捨て，乾燥させて，それぞれ2 uLのTEで溶かした

promoter: 125 ng/2uL，GFP: 106 ng/2uLになっているはず

  • pSB1C3は9月6日にEPcut，エタ沈したものを電気泳動して濃度を確かめた
  • 20 ng/uLくらい

→2 uL使う


Ligation

pSB1C3 2 uL
promoter 2 uL
GFP 2 uL
Mighty Mix 6 uL
T4 ligase 0.4 uL
Total 12.4 uL'
このうち5 uLは先生がエレクトロポレーションに使用．残りを50 uLコンピにTransformation
Retrieved from "http://2010.igem.org/Team:HokkaidoU_Japan/Notebook/September14"