Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August25

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* M 12：コロニー有り
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* 1-3A 34：コロニー有り
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* 1-3A 34でコロニーが観察されたため，培地に問題はなさそう
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* 12の培地は後からChloramphenicolを足したため，濃度にムラができたか
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* 1-3A 12とは明らかに違うコロニーだった．
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→Ligationの問題のほか，Transformationに使うDNAの濃度に問題があるかもしれない．
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=1-3AのDNA量推定=
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1-3A 1 uLをコンピテントセル30 uLに溶かし，Transformationがうまくいった．
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* 1-3A 1 uLを電気泳動し，TransformationできたDNA量を求める．
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→2 ng/uLと推定
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=pSB1C3をエタ沈で濃縮，Ligation=
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===エタ沈===
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# 3 M 酢酸ナトリウム 8.2 uL加える
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# 100%エタノールを205 uL加え，混ぜる
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# 15,00rpm@4℃で10分間遠心する
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# 上清を捨て，500 uL 70%エタノールを加え，混ぜる
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# 15,00rpm@4℃で5分間遠心する
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# 上清を捨て，真空デシケータで乾燥させる
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# DW 8.2 uLを加え，元の10倍に濃縮する
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===Ligation===
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# 8.2 uL DNA solutionに同量のLigation Solutionを加える
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# T4 ligase 1 uLを加え，16℃で30分間インキュベート
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# 明日，電気泳動・ゲル抽・Transformation
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=らおりプライマーで作ったPCR productsのDigestion=
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前日のPCRから，増やすことのできたパーツのDNA量を求めた
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|27 ng/uL
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|GFP
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|1020 bp
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===Digestion 反応系===
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|10x M buffer
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|1 uL
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|DW
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|DNA
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|2.5
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|BSA
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|EcoR I
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|Pst I
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|0.5
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|style="border-top:1px solid #000;"|'''Total'''
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→37℃で60分
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→ラオリプライマーの真価を電気泳動で確認

Revision as of 12:01, 18 September 2010

Transformationの結果

  • M 34：コロニー無し
  • M 12：コロニー有り
  • I 34：コロニー無し
  • I 12：コロニー有り
  • 1-3A 34：コロニー有り
  • 1-3A 12：コロニー有り
  • 1-3A 34でコロニーが観察されたため，培地に問題はなさそう
  • 12の培地は後からChloramphenicolを足したため，濃度にムラができたか
  • 1-3A 12とは明らかに違うコロニーだった．

→Ligationの問題のほか，Transformationに使うDNAの濃度に問題があるかもしれない．


1-3AのDNA量推定

HokkaidoU Japan 20100825a.jpg

1-3A 1 uLをコンピテントセル30 uLに溶かし，Transformationがうまくいった．

  • 1-3A 1 uLを電気泳動し，TransformationできたDNA量を求める．

→2 ng/uLと推定


pSB1C3をエタ沈で濃縮，Ligation

エタ沈

  1. 3 M 酢酸ナトリウム 8.2 uL加える
  2. 100%エタノールを205 uL加え，混ぜる
  3. 15,00rpm@4℃で10分間遠心する
  4. 上清を捨て，500 uL 70%エタノールを加え，混ぜる
  5. 15,00rpm@4℃で5分間遠心する
  6. 上清を捨て，真空デシケータで乾燥させる
  7. DW 8.2 uLを加え，元の10倍に濃縮する

Ligation

  1. 8.2 uL DNA solutionに同量のLigation Solutionを加える
  2. T4 ligase 1 uLを加え，16℃で30分間インキュベート
  3. 明日，電気泳動・ゲル抽・Transformation

らおりプライマーで作ったPCR productsのDigestion

HokkaidoU Japan 20100825c.JPG

前日のPCRから，増やすことのできたパーツのDNA量を求めた

RBS 27 ng/uL 312 bp
GFP 54 ng/uL 1020 bp
dT 49 ng/uL 429 bp

Digestion 反応系

10x M buffer 1 uL
DW 4.5
DNA 2.5
BSA 1
EcoR I 0.5
Pst I 0.5
Total 10 uL

→37℃で60分

→ラオリプライマーの真価を電気泳動で確認
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