Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August25
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=Transformationの結果= | =Transformationの結果= | ||
- | + | ==コロニーの確認== | |
- | + | {| class="protocol" | |
- | + | |- | |
- | + | |M 34 | |
- | + | |なし | |
- | + | |- | |
+ | |M 12 | ||
+ | |あり | ||
+ | |- | ||
+ | |I 34 | ||
+ | |なし | ||
+ | |- | ||
+ | |I 34 | ||
+ | |あり | ||
+ | |- | ||
+ | |1-3A 34 | ||
+ | |あり | ||
+ | |- | ||
+ | |1-3A 12 | ||
+ | |あり | ||
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* 1-3A 12とは明らかに違うコロニーだった. | * 1-3A 12とは明らかに違うコロニーだった. | ||
→Ligationの問題のほか,Transformationに使うDNAの濃度に問題があるかもしれない. | →Ligationの問題のほか,Transformationに使うDNAの濃度に問題があるかもしれない. | ||
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=1-3AのDNA量推定= | =1-3AのDNA量推定= |
Revision as of 05:16, 19 September 2010
Transformationの結果
コロニーの確認
M 34 | なし |
M 12 | あり |
I 34 | なし |
I 34 | あり |
1-3A 34 | あり |
1-3A 12 | あり |
- 1-3A 34でコロニーが観察されたため,培地に問題はなさそう
- 12の培地は後からChloramphenicolを足したため,濃度にムラができたか
- 1-3A 12とは明らかに違うコロニーだった.
→Ligationの問題のほか,Transformationに使うDNAの濃度に問題があるかもしれない.
1-3AのDNA量推定
1-3A 1 uLをコンピテントセル30 uLに溶かし,Transformationがうまくいった.
- 1-3A 1 uLを電気泳動し,TransformationできたDNA量を求める.
→2 ng/uLと推定
pSB1C3をエタ沈で濃縮,Ligation
エタ沈
- 3 M 酢酸ナトリウム 8.2 uL加える
- 100%エタノールを205 uL加え,混ぜる
- 15,00rpm@4℃で10分間遠心する
- 上清を捨て,500 uL 70%エタノールを加え,混ぜる
- 15,00rpm@4℃で5分間遠心する
- 上清を捨て,真空デシケータで乾燥させる
- DW 8.2 uLを加え,元の10倍に濃縮する
Ligation
- 8.2 uL DNA solutionに同量のLigation Solutionを加える
- T4 ligase 1 uLを加え,16℃で30分間インキュベート
- 明日,電気泳動・ゲル抽・Transformation
らおりプライマーで作ったPCR productsのDigestion
前日のPCRから,増やすことのできたパーツのDNA量を求めた
RBS | 27 ng/uL | 312 bp |
GFP | 54 ng/uL | 1020 bp |
dT | 49 ng/uL | 429 bp |
Digestion 反応系
10x M buffer | 1 uL |
DW | 4.5 |
DNA | 2.5 |
BSA | 1 |
EcoR I | 0.5 |
Pst I | 0.5 |
Total | 10 uL |
→37℃で60分
→ラオリプライマーの真価を電気泳動で確認