Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August25

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(→Digestion 反応系)
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→37℃で60分
→37℃で60分
→ラオリプライマーの真価を電気泳動で確認
→ラオリプライマーの真価を電気泳動で確認

Revision as of 07:05, 20 September 2010

Notebook

Transformationの結果

コロニーの確認

Plate Result
M 34 なし
M 12 あり
I 34 なし
I 34 あり
1-3A 34 あり
1-3A 12 あり
  • 1-3A 34でコロニーが観察されたため，培地に問題はなさそう
  • 12の培地は後からChloramphenicolを足したため，濃度にムラができたか
  • 1-3A 12とは明らかに違うコロニーだった．

→Ligationの問題のほか，Transformationに使うDNAの濃度に問題があるかもしれない．

1-3AのDNA量推定

HokkaidoU Japan 20100825a.jpg

1-3A 1 uLをコンピテントセル30 uLに溶かし，Transformationがうまくいった．

  • 1-3A 1 uLを電気泳動し，TransformationできたDNA量を求める．

→2 ng/uLと推定


pSB1C3をエタ沈で濃縮，Ligation

エタ沈

  1. 3 M 酢酸ナトリウム 8.2 uL加える
  2. 100%エタノールを205 uL加え，混ぜる
  3. 15,00rpm@4℃で10分間遠心する
  4. 上清を捨て，500 uL 70%エタノールを加え，混ぜる
  5. 15,00rpm@4℃で5分間遠心する
  6. 上清を捨て，真空デシケータで乾燥させる
  7. DW 8.2 uLを加え，元の10倍に濃縮する

Ligation

  1. 8.2 uL DNA solutionに同量のLigation Solutionを加える
  2. T4 ligase 1 uLを加え，16℃で30分間インキュベート
  3. 明日，電気泳動・ゲル抽・Transformation

らおりプライマーで作ったPCR productsのDigestion

HokkaidoU Japan 20100825c.JPG

前日のPCRから，増やすことのできたパーツのDNA量を求めた

RBS 27 ng/uL 312 bp
GFP 54 ng/uL 1020 bp
dT 49 ng/uL 429 bp

Digestion 反応系

Reagent Amount
10x M buffer 1 uL
DW 4.5
DNA 2.5
BSA 1
EcoR I 0.5
Pst I 0.5
Total 10 uL

→37℃で60分

→ラオリプライマーの真価を電気泳動で確認
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