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Transformationの結果

コロニーの確認

Plate	Result
M 34	なし
M 12	あり
I 34	なし
I 34	あり
1-3A 34	あり
1-3A 12	あり

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• 1-3A 34でコロニーが観察されたため，培地に問題はなさそう
• 12の培地は後からChloramphenicolを足したため，濃度にムラができたか
• 1-3A 12とは明らかに違うコロニーだった．

→Ligationの問題のほか，Transformationに使うDNAの濃度に問題があるかもしれない．

1-3AのDNA量推定

1-3A 1 uLをコンピテントセル30 uLに溶かし，Transformationがうまくいった．

• 1-3A 1 uLを電気泳動し，TransformationできたDNA量を求める．

→2 ng/uLと推定

pSB1C3をエタ沈で濃縮，Ligation

エタ沈

1. 3 M 酢酸ナトリウム 8.2 uL加える
2. 100%エタノールを205 uL加え，混ぜる
3. 15,00rpm@4℃で10分間遠心する
4. 上清を捨て，500 uL 70%エタノールを加え，混ぜる
5. 15,00rpm@4℃で5分間遠心する
6. 上清を捨て，真空デシケータで乾燥させる
7. DW 8.2 uLを加え，元の10倍に濃縮する

Ligation

1. 8.2 uL DNA solutionに同量のLigation Solutionを加える
2. T4 ligase 1 uLを加え，16℃で30分間インキュベート
3. 明日，電気泳動・ゲル抽・Transformation

らおりプライマーで作ったPCR productsのDigestion

前日のPCRから，増やすことのできたパーツのDNA量を求めた

RBS	27 ng/uL	312 bp
GFP	54 ng/uL	1020 bp
dT	49 ng/uL	429 bp

Digestion 反応系

Reagent	Amount
10x M buffer	1 uL
DW	4.5
DNA	2.5
BSA	1
EcoR I	0.5
Pst I	0.5
Total	10 uL

→37℃で60分

→ラオリプライマーの真価を電気泳動で確認