Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August25

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=Transformationの結果=
=Transformationの結果=
* M 34:コロニー無し
* M 34:コロニー無し

Revision as of 14:58, 18 September 2010

Transformationの結果

  • M 34:コロニー無し
  • M 12:コロニー有り
  • I 34:コロニー無し
  • I 12:コロニー有り
  • 1-3A 34:コロニー有り
  • 1-3A 12:コロニー有り

  • 1-3A 34でコロニーが観察されたため,培地に問題はなさそう
  • 12の培地は後からChloramphenicolを足したため,濃度にムラができたか
  • 1-3A 12とは明らかに違うコロニーだった.

→Ligationの問題のほか,Transformationに使うDNAの濃度に問題があるかもしれない.


1-3AのDNA量推定

HokkaidoU Japan 20100825a.jpg

1-3A 1 uLをコンピテントセル30 uLに溶かし,Transformationがうまくいった.

  • 1-3A 1 uLを電気泳動し,TransformationできたDNA量を求める.

→2 ng/uLと推定


pSB1C3をエタ沈で濃縮,Ligation

エタ沈

  1. 3 M 酢酸ナトリウム 8.2 uL加える
  2. 100%エタノールを205 uL加え,混ぜる
  3. 15,00rpm@4℃で10分間遠心する
  4. 上清を捨て,500 uL 70%エタノールを加え,混ぜる
  5. 15,00rpm@4℃で5分間遠心する
  6. 上清を捨て,真空デシケータで乾燥させる
  7. DW 8.2 uLを加え,元の10倍に濃縮する

Ligation

  1. 8.2 uL DNA solutionに同量のLigation Solutionを加える
  2. T4 ligase 1 uLを加え,16℃で30分間インキュベート
  3. 明日,電気泳動・ゲル抽・Transformation

らおりプライマーで作ったPCR productsのDigestion

HokkaidoU Japan 20100825c.JPG

前日のPCRから,増やすことのできたパーツのDNA量を求めた

RBS 27 ng/uL 312 bp
GFP 54 ng/uL 1020 bp
dT 49 ng/uL 429 bp

Digestion 反応系

10x M buffer 1 uL
DW 4.5
DNA 2.5
BSA 1
EcoR I 0.5
Pst I 0.5
Total 10 uL

→37℃で60分

→ラオリプライマーの真価を電気泳動で確認