Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August18

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(→RBS)
(→Ligationに必要なDNA Solutionの調製)
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|RFP
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|700 bp
|700 bp
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|double terminator
|double terminator
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|0.5 ng/uL
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|style="border-top:1px solid #000;"|'''6.3 uL'''
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===Ligation & Transformation===
===Ligation & Transformation===
{|style="text-align:center;" class="protocol"
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Revision as of 05:05, 19 September 2010

Notebook

RBS digestionのリベンジ

HokkaidoU Japan 20100818a.JPG
1-2M 10 uL
DW 4 uL
10x M Buffer 2 uL
BSA 2 uL
Xba I 1 uL
Pst I 1 uL
Total 20 uL

→37℃で60分インキュベーション

  • 4 uL 6x Sample Bufferを加え，12 uLずつ電気泳動した

→ゲル抽出
→10 uLを電気泳動で確認（TSUDA Marker 1）

だめぽでした！

  • おそらくゲル抽出後の吸着でうまくいかず，流れてしまった（小さすぎた）

Ligation

Ligationに必要なDNA Solutionの調製

パーツ λ/Hind IIIと比べて (ng/10 uL) ng/uL 割合 size (bp) 必要 (ng) 使用 (uL)
Vector 50 ng/10 uL 5 ng/uL 1 2000 bp 10 ng 2 uL
RFP 250 ng/10 uL 25 ng/uL 2 700 bp 7 ng 0.3 uL
double terminator 5 ng/10 uL 0.5 ng/uL 2 200 bp 2 ng 4 uL
Total 6.3 uL

Ligation & Transformation

DNA solution 6.3 uL
Ligation solution 6.3 uL
T4 ligase 1 uL
  • 16℃，30 min
  • competent cell 50 uLに全量加えた（Transformation）
  • 0℃，30 min
  • 42℃，60 sec
  • 5 min on ice
  • add LB 100 uL
  • 37℃，120 min
  • spread onto the LBC
  • 37℃，15~20 hrs


RBS 再リベンジ

Digestion後，エタ沈で回収を試みた

Digestion (Xba I, Pst I)

（RBS）1-2M 10 uL
DW 4 uL
10x M Buffer 2 uL
BSA 2 uL
Xba I 1 uL
Pst I 1 uL
Total 20 uL

→37℃，60 min

エタ沈

  • 2 uLの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
  • 44 uLのエタノールを加えた
  • 液体窒素の中で凍らせた（1.5 mLのチューブに移す）
  • 溶かしてから15,000 rpm @4℃で５分間遠心した
  • 上清をほかのチューブに移した（一応これも遠心し，上清を捨て，同じ操作をした）
  • 100 uLの70%エタノールで壁をリンスし，15,000 rpm @4℃で５分間遠心した
  • 上清を捨て，真空デシケータで乾燥させた
  • TE 5 uLで溶かした

電気泳動

HokkaidoU Japan 20100818b.JPG
  • TEで溶かしたDNA Solution 1 uLに6x SB 1 uLを加えた
  • 最初にとった上清も同じ操作をした
レーン
2 TSUDA Marker 1
3 上清
4 DNA solution
  • DNA solutionにしっかり回収されていた
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