Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August18
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+ | * 0℃,30 min | ||
+ | * 42℃,60 sec | ||
+ | * 5 min on ice | ||
+ | * add LB 100 uL | ||
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+ | →37℃,60 min | ||
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+ | ==エタ沈== | ||
+ | * 2 uLの3 M 酢酸ナトリウムを加えた | ||
+ | * 44 uLのエタノールを加えた | ||
+ | * 液体窒素の中で凍らせた('''1.5 mLのチューブに移す''') | ||
+ | * 溶かしてから15,000 rpm @4℃で5分間遠心した | ||
+ | * 上清をほかのチューブに移した(一応これも遠心し,上清を捨て,同じ操作をした) | ||
+ | * 100 uLの70%エタノールで壁をリンスし,15,000 rpm @4℃で5分間遠心した | ||
+ | * 上清を捨て,真空デシケータで乾燥させた | ||
+ | * TE 5 uLで溶かした | ||
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+ | ==電気泳動== | ||
+ | [[Image:HokkaidoU Japan 20100818b.JPG|200px|right|thumb|]] | ||
+ | * TEで溶かしたDNA Solution 1 uLに6x SB 1 uLを加えた | ||
+ | * 最初にとった上清も同じ操作をした | ||
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+ | |DNA solution | ||
+ | |} | ||
+ | * DNA solutionにしっかり回収されていた |
Revision as of 11:53, 18 September 2010
RBS digestionのリベンジ
RBS
1-2M | 10 uL |
DW | 4 uL |
10x M Buffer | 2 uL |
BSA | 2 uL |
Xba I | 1 uL |
Pst I | 1 uL |
Total | 20 uL |
→37℃で60分インキュベーション
- 4 uL 6x Sample Bufferを加え,12 uLずつ電気泳動した
→ゲル抽出
→10 uLを電気泳動で確認(TSUDA Marker 1)
だめぽでした!
- おそらくゲル抽出後の吸着でうまくいかず,流れてしまった(小さすぎた)
Ligation
Ligationに必要なDNA Solutionの調製
パーツ | λ/Hind IIIと比べて (ng/10 uL) | ng/uL | 割合 | size (bp) | 必要 (ng) | 使用 (uL) |
Vector | 50 ng/10 uL | 5 ng/uL | 1 | 2000 bp | 10 ng | 2 uL |
RFP | 250 ng/uL | 25 ng/10 uL | 2 | 700 bp | 7 ng | 0.3 uL |
double terminator | 5 ng/uL | 0.5 ng/uL | 2 | 200 bp | 2 ng | 4 uL |
Total | 6.3 uL |
Ligation & Transformation
DNA solution | 6.3 uL |
Ligation solution | 6.3 uL |
T4 ligase | 1 uL |
- 16℃,30 min
- competent cell 50 uLに全量加えた(Transformation)
- 0℃,30 min
- 42℃,60 sec
- 5 min on ice
- add LB 100 uL
- 37℃,120 min
- spread onto the LBC
- 37℃,15~20 hrs
RBS 再リベンジ
Digestion後,エタ沈で回収を試みた
Digestion (Xba I, Pst I)
(RBS)1-2M | 10 uL |
DW | 4 uL |
10x M Buffer | 2 uL |
BSA | 2 uL |
Xba I | 1 uL |
Pst I | 1 uL |
Total | 20 uL |
→37℃,60 min
エタ沈
- 2 uLの3 M 酢酸ナトリウムを加えた
- 44 uLのエタノールを加えた
- 液体窒素の中で凍らせた(1.5 mLのチューブに移す)
- 溶かしてから15,000 rpm @4℃で5分間遠心した
- 上清をほかのチューブに移した(一応これも遠心し,上清を捨て,同じ操作をした)
- 100 uLの70%エタノールで壁をリンスし,15,000 rpm @4℃で5分間遠心した
- 上清を捨て,真空デシケータで乾燥させた
- TE 5 uLで溶かした
電気泳動
- TEで溶かしたDNA Solution 1 uLに6x SB 1 uLを加えた
- 最初にとった上清も同じ操作をした
レーン | |
2 | TSUDA Marker 1 |
3 | 上清 |
4 | DNA solution |
- DNA solutionにしっかり回収されていた