Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August10

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シングルコロニーアイソレーション

コロニーを確認したところ,3-1Eにはコロニーが見られなかった
ほかのプレートもコロニー数が少なかったため,手順に不完全なところがあったのかもしれない

  • 実験中に沈殿が見られたため
    • コンピテントセルの溶解が不十分だった?
    • 混ぜ方が不十分だった?
  • 2回目の実験で,若干急いだ感じだったので,吸着などが不十分だった?

3-1E以外を新しい培地に移した

PCR反応液の調整

今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した.

Autoclaved DW 165 uL
10x PCR buffer 25 uL
2 mM dNTPs 25 uL
25 mM MgSO4 15 uL
EX-F primer 5 uL
PS-R primer 5 uL
KOD plus Neo 5 uL
Total 245 uL
  • 反応液49 uLを4本のPCRチューブに分注し,Templateを1 uLずつ加えた
  • それぞれのPCRチューブとTemplate,lengthは
1 2-24G(sender) 847 bp
2 1-2M(RBS) 61 bp
3 1-23L(terminator) 178 bp
4 3-1E(heat sensor) 984 bp
  • DNA lengthはパーツ長+プライマー(49 bp)
  • 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため

PCR program

Predenature 94℃ 2 min
Denature 98℃ 10 sec
Extension 68℃ 30 sec
  • 30 cycle
  • 30 sec/kbpなので1cycle30秒で行った

電気泳動

  • 増幅したDNAを5 uLとって6xサンプルバッファー1 uLを加えた
  • マーカーはpUC119/Hinf1を使用
  • エチブロは20 uL使用
short discription