Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August10

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(→Single Colony Isolation)
(→PCR反応液の調整)
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3-1E以外を新しい培地に移した
3-1E以外を新しい培地に移した
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==PCR反応液の調整==
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==PCR Reaction System==
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Reaction system was prepared for 3 parts, 245 uL in total
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| Autoclaved DW
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| 165 uL
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| 10x PCR buffer
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| 25 uL
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| 2 mM dNTPs
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| 25 uL
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| 25 mM MgSO<sub>4</sub>
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| 15 uL
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| EX-F primer
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| 5 uL
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| PS-R primer
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| 5 uL
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| KOD plus Neo
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| 5 uL
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* 反応液49 uLを４本のPCRチューブに分注し，Templateを1 uLずつ加えた
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* それぞれのPCRチューブとTemplate，lengthは
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!Amount
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| 1
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| 2-24G（sender）
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| 847 bp
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| 2
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| 1-2M（RBS）
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| 61 bp
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|-
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| 3
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| 1-23L（terminator）
 +
| 178 bp
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|-
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| 4
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| 3-1E（heat sensor）
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| 984 bp
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* DNA lengthはパーツ長＋プライマー(49 bp)
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* 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため
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==PCR反応液の調整 ==
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==
今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した．
今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した．
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{|style="text-align: center; margin-left:20px" class="protocol"

Revision as of 05:24, 20 September 2010

Notebook

Single Colony Isolation

  • Observed if any colonies were made
    • Could not see 3-1E
  • Number of other colonies on other plates was also very small
    • Mistake in protocol is inferred
    • Precipitation of cells maybe at fault
  • All but 3-1E was moved to new plates

シングルコロニーアイソレーション

コロニーを確認したところ，3-1Eにはコロニーが見られなかった
ほかのプレートもコロニー数が少なかったため，手順に不完全なところがあったのかもしれない

  • 実験中に沈殿が見られたため
    • コンピテントセルの溶解が不十分だった？
    • 混ぜ方が不十分だった？
  • ２回目の実験で，若干急いだ感じだったので，吸着などが不十分だった？

3-1E以外を新しい培地に移した

PCR Reaction System

Reaction system was prepared for 3 parts, 245 uL in total

Reagent Amount
Autoclaved DW 165 uL
10x PCR buffer 25 uL
2 mM dNTPs 25 uL
25 mM MgSO4 15 uL
EX-F primer 5 uL
PS-R primer 5 uL
KOD plus Neo 5 uL
Total 245 uL
  • 反応液49 uLを４本のPCRチューブに分注し，Templateを1 uLずつ加えた
  • それぞれのPCRチューブとTemplate，lengthは
Reagent Amount
1 2-24G（sender） 847 bp
2 1-2M（RBS） 61 bp
3 1-23L（terminator） 178 bp
4 3-1E（heat sensor） 984 bp
  • DNA lengthはパーツ長＋プライマー(49 bp)
  • 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため

PCR反応液の調整

== 今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した．

Autoclaved DW 165 uL
10x PCR buffer 25 uL
2 mM dNTPs 25 uL
25 mM MgSO4 15 uL
EX-F primer 5 uL
PS-R primer 5 uL
KOD plus Neo 5 uL
Total 245 uL
  • 反応液49 uLを４本のPCRチューブに分注し，Templateを1 uLずつ加えた
  • それぞれのPCRチューブとTemplate，lengthは
1 2-24G（sender） 847 bp
2 1-2M（RBS） 61 bp
3 1-23L（terminator） 178 bp
4 3-1E（heat sensor） 984 bp
  • DNA lengthはパーツ長＋プライマー(49 bp)
  • 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため

PCR program

Predenature 94℃ 2 min
Denature 98℃ 10 sec
Extension 68℃ 30 sec
Hold 4℃
  • 30 cycle
  • 30 sec/kbpなので１cycle30秒で行った

電気泳動

  • 増幅したDNAを5 uLとって6xサンプルバッファー1 uLを加えた
  • マーカーはpUC119/Hinf1を使用
  • エチブロは20 uL使用
short discription
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