Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August10
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+ | * 実験中に沈殿が見られたため | ||
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+ | * 2回目の実験で,若干急いだ感じだったので,吸着などが不十分だった? | ||
+ | 3-1E以外を新しい培地に移した | ||
==シングルコロニーアイソレーション== | ==シングルコロニーアイソレーション== |
Revision as of 04:54, 20 September 2010
single Isolation
- Observed if any colonies were made
- Could not see 3-1E
- Number of other colonies on other plates was also very small
- Mistake in protocol is inferred
- During experiment was
- 実験中に沈殿が見られたため
- コンピテントセルの溶解が不十分だった?
- 混ぜ方が不十分だった?
- 2回目の実験で,若干急いだ感じだったので,吸着などが不十分だった?
3-1E以外を新しい培地に移した
シングルコロニーアイソレーション
コロニーを確認したところ,3-1Eにはコロニーが見られなかった
ほかのプレートもコロニー数が少なかったため,手順に不完全なところがあったのかもしれない
- 実験中に沈殿が見られたため
- コンピテントセルの溶解が不十分だった?
- 混ぜ方が不十分だった?
- 2回目の実験で,若干急いだ感じだったので,吸着などが不十分だった?
3-1E以外を新しい培地に移した
PCR反応液の調整
今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した.
Autoclaved DW | 165 uL |
10x PCR buffer | 25 uL |
2 mM dNTPs | 25 uL |
25 mM MgSO4 | 15 uL |
EX-F primer | 5 uL |
PS-R primer | 5 uL |
KOD plus Neo | 5 uL |
Total | 245 uL |
- 反応液49 uLを4本のPCRチューブに分注し,Templateを1 uLずつ加えた
- それぞれのPCRチューブとTemplate,lengthは
1 | 2-24G(sender) | 847 bp |
2 | 1-2M(RBS) | 61 bp |
3 | 1-23L(terminator) | 178 bp |
4 | 3-1E(heat sensor) | 984 bp |
- DNA lengthはパーツ長+プライマー(49 bp)
- 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため
PCR program
Predenature | 94℃ 2 min |
Denature | 98℃ 10 sec |
Extension | 68℃ 30 sec |
Hold | 4℃ |
- 30 cycle
- 30 sec/kbpなので1cycle30秒で行った
電気泳動
- 増幅したDNAを5 uLとって6xサンプルバッファー1 uLを加えた
- マーカーはpUC119/Hinf1を使用
- エチブロは20 uL使用