Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August10

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(PCR program)
(シングルコロニーアイソレーション)
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==single Isolation==
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* Observed if any colonies were made
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** Could not see 3-1E
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* Number of other colonies on other plates was also very small
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** Mistake in protocol is inferred
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* During experiment was
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* 実験中に沈殿が見られたため
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** コンピテントセルの溶解が不十分だった?
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** 混ぜ方が不十分だった?
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* 2回目の実験で,若干急いだ感じだったので,吸着などが不十分だった?
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3-1E以外を新しい培地に移した
==シングルコロニーアイソレーション==
==シングルコロニーアイソレーション==

Revision as of 04:54, 20 September 2010

single Isolation

  • Observed if any colonies were made
    • Could not see 3-1E
  • Number of other colonies on other plates was also very small
    • Mistake in protocol is inferred
  • During experiment was


  • 実験中に沈殿が見られたため
    • コンピテントセルの溶解が不十分だった?
    • 混ぜ方が不十分だった?
  • 2回目の実験で,若干急いだ感じだったので,吸着などが不十分だった?

3-1E以外を新しい培地に移した

シングルコロニーアイソレーション

コロニーを確認したところ,3-1Eにはコロニーが見られなかった
ほかのプレートもコロニー数が少なかったため,手順に不完全なところがあったのかもしれない

  • 実験中に沈殿が見られたため
    • コンピテントセルの溶解が不十分だった?
    • 混ぜ方が不十分だった?
  • 2回目の実験で,若干急いだ感じだったので,吸着などが不十分だった?

3-1E以外を新しい培地に移した

PCR反応液の調整

今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した.

Autoclaved DW 165 uL
10x PCR buffer 25 uL
2 mM dNTPs 25 uL
25 mM MgSO4 15 uL
EX-F primer 5 uL
PS-R primer 5 uL
KOD plus Neo 5 uL
Total 245 uL
  • 反応液49 uLを4本のPCRチューブに分注し,Templateを1 uLずつ加えた
  • それぞれのPCRチューブとTemplate,lengthは
1 2-24G(sender) 847 bp
2 1-2M(RBS) 61 bp
3 1-23L(terminator) 178 bp
4 3-1E(heat sensor) 984 bp
  • DNA lengthはパーツ長+プライマー(49 bp)
  • 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため

PCR program

Predenature 94℃ 2 min
Denature 98℃ 10 sec
Extension 68℃ 30 sec
Hold 4℃
  • 30 cycle
  • 30 sec/kbpなので1cycle30秒で行った

電気泳動

  • 増幅したDNAを5 uLとって6xサンプルバッファー1 uLを加えた
  • マーカーはpUC119/Hinf1を使用
  • エチブロは20 uL使用
short discription