Team:HokkaidoU Japan/Notebook/August10

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コロニーを確認したところ，3-1Eにはコロニーが見られなかった<br>
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ほかのプレートもコロニー数が少なかったため，手順に不完全なところがあったのかもしれない
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* 実験中に沈殿が見られたため
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** コンピテントセルの溶解が不十分だった？
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** 混ぜ方が不十分だった？
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* ２回目の実験で，若干急いだ感じだったので，吸着などが不十分だった？
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3-1E以外を新しい培地に移した
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==PCR反応液の調整==
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今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した．
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* 反応液49 uLを４本のPCRチューブに分注し，Templateを1 uLずつ加えた
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* それぞれのPCRチューブとTemplate，lengthは
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| 3-1E（heat sensor）
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| 984 bp
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* DNA lengthはパーツ長＋プライマー(49 bp)
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* 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため
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==PCR program==
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| Predenature
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| 94℃ 2 min
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| 98℃ 10 sec
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| 68℃ 30 sec
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* 30 cycle
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* 30 sec/kbpなので１cycle30秒で行った
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==[[アガロースゲル電気泳動|電気泳動]]==
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* 増幅したDNAを5 uLとって6xサンプルバッファー1 uLを加えた
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* マーカーはpUC119/''Hin''f1を使用
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* エチブロは20 uL使用
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Revision as of 11:24, 18 September 2010

シングルコロニーアイソレーション

コロニーを確認したところ，3-1Eにはコロニーが見られなかった
ほかのプレートもコロニー数が少なかったため，手順に不完全なところがあったのかもしれない

  • 実験中に沈殿が見られたため
    • コンピテントセルの溶解が不十分だった？
    • 混ぜ方が不十分だった？
  • ２回目の実験で，若干急いだ感じだったので，吸着などが不十分だった？

3-1E以外を新しい培地に移した

PCR反応液の調整

今回は4パーツ増幅のためTotal 245 uL作成した．

Autoclaved DW 165 uL
10x PCR buffer 25 uL
2 mM dNTPs 25 uL
25 mM MgSO4 15 uL
EX-F primer 5 uL
PS-R primer 5 uL
KOD plus Neo 5 uL
Total 245 uL
  • 反応液49 uLを４本のPCRチューブに分注し，Templateを1 uLずつ加えた
  • それぞれのPCRチューブとTemplate，lengthは
1 2-24G（sender） 847 bp
2 1-2M（RBS） 61 bp
3 1-23L（terminator） 178 bp
4 3-1E（heat sensor） 984 bp
  • DNA lengthはパーツ長＋プライマー(49 bp)
  • 3-1EはTransformationがうまくいかなかったため

PCR program

Predenature 94℃ 2 min
Denature 98℃ 10 sec
Extension 68℃ 30 sec
  • 30 cycle
  • 30 sec/kbpなので１cycle30秒で行った

電気泳動

  • 増幅したDNAを5 uLとって6xサンプルバッファー1 uLを加えた
  • マーカーはpUC119/Hinf1を使用
  • エチブロは20 uL使用
short discription
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