http://2010.igem.org/wiki/index.php?title=Special:Contributions/Drosuke&feed=atom&limit=50&target=Drosuke&year=&month=2010.igem.org - User contributions [en]2024-03-28T23:04:51ZFrom 2010.igem.orgMediaWiki 1.16.5http://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T13:54:38Z<p>Drosuke: /* 要旨 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli'' Pen": Draw with your own color.'''<br />
::私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<html><body><div align=center><br />
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2010/a/ae/10.jpg" onmouseover="this.src='https://static.igem.org/mediawiki/2010/6/62/11.jpg'" onmouseout="this.src='https://static.igem.org/mediawiki/2010/a/ae/10.jpg'"></div></body></html><br><br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:88.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
<html><body><div align=center><br />
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2010/9/92/Genes.jpg" onmouseover="this.src='https://static.igem.org/mediawiki/2010/e/ee/Tono.jpg'" onmouseout="this.src='https://static.igem.org/mediawiki/2010/9/92/Genes.jpg'"></div></body></html><br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:::[[Image:5.jpg|500px|left|thumb|Fig.1 OxyRは酸化ストレスに応答する抗酸化遺伝子の発現における転写調節因子である。OxyRタンパク質は恒性的に生産され、過酸化水素によって酸化される。酸化型(活性型)OxyRは<I>ahpC</I>遺伝子のプロモーター領域(OxyRタンパク質結合領域:OBR)に結合し、<I>ahpC</I>遺伝子の転写を促進する。]]<br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:::[[Image:81.jpg|left|600px|thumb|Fig.2 <I>sufA</I>オペロン(<I>sufABCDSE)はFe-Sクラスターの構築に関与している。<I>sufA</I>遺伝子の発現は過酸化物や過酸化水素によって誘導する。<I>sufA</I>遺伝子の近領域にはOxyRタンパク質結合領域(OBR)が存在し、OxyRは<I>sufA</I>オペロンの活性化因子の一つとして機能している。]]<br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br />
<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
:: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。<br />
:[[Image:66.jpg|center|900px]]<br />
<br><br />
:[http://www.youtube.com/user/KITKyoto#p/u/9/DVVq0MWgRFk >>"<I>E.coli</I> Pen"のシステム]<br />
:[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br><br><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5 Alpha)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5 Alpha)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5 Alpha)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5 Alphaの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5 AlphaをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:::[[Image:0826-生存曲線.jpg|thumb|300px|left|Fig.3]]<br><br><br />
<br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなわち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:::[[Image:0826-引用画像.jpg|left|300px|thumb|Fig.4]]<br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図4(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
:::[[Image:g1.jpg|left|400px|thumb|Fig.5]]<br />
<br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。実験方法は、それぞれ作製したコンストラクトを含む大腸菌を37℃下において1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
<br />
''' 3-1.ahpC (BBa_K362001) '''<br />
: まず、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5 Alphaコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
<br />
:::[[Image:AhpC.jpg|left|400px|thumb|Fig.6]]<br />
<br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br />
<br />
: Fig.6はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。 <br />
<br />
''' 3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
:::[[Image:SufA graph.jpg|left|400px|thumb|Fig.7]]<br />
<br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br><br />
<br />
<br />
: Fig.7はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
''' 4-1. 様々な色によるインクの作成 '''<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig.8 LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。Fig.8はPBS とLB培地の比較を示しています。Fig.8 C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig.9 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図9)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|Fig.10 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
''' 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について '''<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(Fig.11)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。Fig.11が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig.11 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px| <br />
Fig.12 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig.13 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig.14 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig.15 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig.16 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig.17 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig.18 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig.19 浮世絵]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig.20 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig.21 鶴]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig.22 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNoteTeam:KIT-Kyoto/DesignNote2010-10-27T03:41:09Z<p>Drosuke: /* Time Table */</p>
<hr />
<div><html><head><br />
<style type=text/css><br />
.tblsample table, .tblsample tr, .tblsample td {border:0px;<br />
cellpadding:5;<br />
cellspacing:1;<br />
bgcolor:none;<br />
background:url();<br />
<br />
}<br />
</style><br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Note|Notebook]] > [[Team:KIT-Kyoto/DesignNote|Design Note]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/DesignNote|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/DesignNoteJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td width="165px" valign="top" align="left">{{Template:KIT-Kyoto/menu12}}<br />
</td><td width="800px" valign="top"><div id="MIGI"><br />
== Design Note ==<br />
{|<br />
|[[Image:Desno.gif]]||<br />
In this occasion, we have added a new Design Team constituted mainly of Design Students at KIT. Here we describe the activities of this Design Group.The main theme of our project is "At the Intersection of Art and Science" . <br />
The underlying reason for this selection of this theme is our desire to connect people with science. The poster of our proposed work “''E.coli'' pen and Wiki” was entirely crafted by the design group. We hope that the work of the design group enhances the interest of more people towards synthetic biology.<br />
|}<br />
<br />
== Member ==<br />
[[Image:DESAMEM.PNG|right]]<br />
:B3 Kokado Naoya (CG Design)<BR><br />
:B3 Tsuchida Miki (Illust)<BR><br />
:B3 Matsubara Akiko (Translation, Wiki)<BR><br />
:B3 Sakata Junichi (Poster, Document)<BR><br />
:B1 Adachi Yuka (Wiki)<BR><br />
<BR><br />
<br />
<br />
<!--【キムワイプの中心で愛を叫ぶ -その1-】<br />
理系の大学に通う身にとって、キムワイプとは研究室に同居する非常に身近な存在であり、また敬愛すべき存在でもある。<br />
キムワイプの存在なくしては我々は快適な研究生活を送ることが出来ない。<br />
それはいわば理系研究者の神であり、紙でもある。--><br />
<br />
== Time Table ==<br />
:Wiki, CG Design (Aug22-Oct23)<br />
::9:00-19:00(sometimes 9:00-22:00)<br />
:Flash, Poster, Presentation Design (Oct1-Nov1)<br />
::Mon.-Fry. After school<br />
::Sat. Sun. 9:00-23:00<br />
:Regular meeting<br />
::Every Fryday 19:00-21:00<br />
<br />
<br />
</div></td></tr></table><br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T03:38:46Z<p>Drosuke: /* 要旨 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli'' Pen": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。実験方法は、それぞれ作製したコンストラクトを含む大腸菌を37℃下において1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
<br />
''' 3-1.ahpC (BBa_K362001) '''<br />
: まず、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。 <br />
<br />
''' 3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
''' 4-1. 様々な色によるインクの作成 '''<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
''' 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について '''<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T03:38:03Z<p>Drosuke: /* Abstract */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli'' Pen": Draw with your own color.'''<br />
:::[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
:In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
:In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
::''E.coli'' cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (O.D.600) of the medium became 0.4~0.5. Cells were suspended in PBS to obtain the initial O.D.600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF.<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<BR><br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the active oxygen response promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. Here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter among 7 promoters which we constructed. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T03:13:44Z<p>Drosuke: /* 3. Constructing an expression system */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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background-color: transparent; <br />
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<br />
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}<br />
<br />
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}<br />
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</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
:In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
:In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<BR><br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the active oxygen response promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. Here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter among 7 promoters which we constructed. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
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# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
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# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T02:35:31Z<p>Drosuke: /* 3. 活性酸素の検出感度について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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</head></html><br />
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<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。実験方法は、それぞれ作製したコンストラクトを含む大腸菌を37℃下において1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
<br />
''' 3-1.ahpC (BBa_K362001) '''<br />
: まず、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。 <br />
<br />
''' 3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
''' 4-1. 様々な色によるインクの作成 '''<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
''' 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について '''<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T02:28:58Z<p>Drosuke: /* 3-2. sufA (BBa_K362005) */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
''' 3-1.ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
''' 3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
''' 4-1. 様々な色によるインクの作成 '''<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
''' 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について '''<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T02:28:22Z<p>Drosuke: /* 3-1.ahpC (BBa_K362001) */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
''' 3-1.ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
''' 4-1. 様々な色によるインクの作成 '''<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
''' 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について '''<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T02:27:23Z<p>Drosuke: /* 4-2. E.coli Penを用いた芸術作品について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
''' 4-1. 様々な色によるインクの作成 '''<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
''' 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について '''<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T02:26:49Z<p>Drosuke: /* 4-1. 様々な色によるインクの作成 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
ul.acc li ul { <br />
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<br />
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}<br />
<br />
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</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
''' 4-1. 様々な色によるインクの作成 '''<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T02:25:20Z<p>Drosuke: /* 結果と考察 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T02:23:28Z<p>Drosuke: /* 諸論 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T02:22:02Z<p>Drosuke: /* 諸論 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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list-style: none; <br />
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<br />
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height: 30px; <br />
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<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
:: AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:19:41Z<p>Drosuke: /* 1. Susceptibility to H2O2 in Escherichia coli */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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</head></html><br />
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<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
:In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
:In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<BR><br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:18:52Z<p>Drosuke: /* 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
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</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
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width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
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list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
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height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
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}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
:In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
:In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<BR><br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:18:08Z<p>Drosuke: /* 3. Constructing an expression system */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
::In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
::In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<BR><br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:17:17Z<p>Drosuke: /* 3. Constructing an expression system */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
::In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
::In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<BR><br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:16:55Z<p>Drosuke: /* 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
::In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
::In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<BR><br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:14:32Z<p>Drosuke: /* 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
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}); <br />
}); <br />
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<br />
<style type="text/css"> <br />
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} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
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<br />
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<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
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}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
::In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
::In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<BR><br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:14:02Z<p>Drosuke: /* 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
::In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
::In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:13:19Z<p>Drosuke: /* 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
::In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
::In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:12:46Z<p>Drosuke: /* 1. Susceptibility to H2O2 in Escherichia coli */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<BR><br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
::In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
::In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
:'''<Result>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T02:11:23Z<p>Drosuke: /* 3. Constructing an expression system */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
::In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
::In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
:'''<Result>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
<br />
'''<Results>'''<BR><br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<BR> <br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T02:00:09Z<p>Drosuke: /* 4. インクの作製について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:59:44Z<p>Drosuke: /* 4. インクの作製について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
: 次に私達はインクの作製について取りかかりました。<br />
<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:55:37Z<p>Drosuke: /* 4-2. E.coli Penを用いた芸術作品について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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</head></html><br />
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<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
: 最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないと分かりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:54:30Z<p>Drosuke: /* 3-2. sufA (BBa_K362005) */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
: さらに、私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:53:40Z<p>Drosuke: /* 3-1.ahpC (BBa_K362001) */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
: 私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:53:12Z<p>Drosuke: /* 3. 活性酸素の検出感度について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
: 続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いてそれぞれ作製しましたが、ここでは、特に活性が高く検出されたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:52:15Z<p>Drosuke: /* 3. 活性酸素の検出感度について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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background-color: transparent; <br />
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<br />
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}<br />
<br />
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</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
:続きまして、私たちは、活性酸素に応答して蛍光タンパク質を発現するコンストラクトの作製にとりかかりました。7種類の活性酸素に応答するプロモーターを用いて作製しましたが、ここでは、特に活性が高く見られたahpCとsufAについて注目し、その実験結果を紹介します。<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:49:14Z<p>Drosuke: /* 2. 適切なベクターの選択について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
: <I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
: 一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
:: 低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:47:40Z<p>Drosuke: /* 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)の図17B(大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す)。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:46:42Z<p>Drosuke: /* 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:45:57Z<p>Drosuke: /* 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。<br />
:参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:45:00Z<p>Drosuke: /* 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
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<br />
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j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
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<br />
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<br />
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j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
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}); <br />
}); <br />
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<br />
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} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
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height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
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float: left;<br />
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}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
: ''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
: ここで得られたデータは以下の引用文献とも一致しています。すなはち、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかりました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。<br />
::参考文献:桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:41:38Z<p>Drosuke: /* 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
:''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
: 得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
:また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
:以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断しました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。<br />
::桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
:参考文献より、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかる。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:39:48Z<p>Drosuke: /* 諸論 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]] 私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
: 現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
: 私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
:: 私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
:: これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
:: このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
:: では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:: 大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
:: OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:: SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
: ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。作られた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの構造や詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
:''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。<br />
しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
:また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
:以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断しました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。<br />
::桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
:参考文献より、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかる。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T01:36:42Z<p>Drosuke: /* 要旨 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
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}); <br />
}); <br />
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</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
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} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
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align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
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} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
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}<br />
<br />
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}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]] 私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]]私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
:現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
:私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
::私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
::これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
::このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
::では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
::大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
::OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
::SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
:ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。できた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
:''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。<br />
しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
:また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
:以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断しました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。<br />
::桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
:参考文献より、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかる。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJTeam:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ2010-10-27T01:01:43Z<p>Drosuke: /* KIT VL研究プロジェクト */</p>
<hr />
<div>{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Human Practice]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPractice |English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
== '''はじめに''' ==<br />
<br />
: 現在、国際的に理科離れが進んでおり、どのようにScience Communicationを図るのかが問題となっています。日本でもその傾向が見られ、特に合成生物学の主幹技術である遺伝子組換え技術においては、「何か怖いものだ」という認識が根強くあります。遺伝子組換えとはどういったことなのか正しい理解もされていないまま、遺伝子組換え食品などは市場から実質的に排除されてしまっているのが現状です。今後、合成生物学が発達していくに伴って、国際的にこうした問題がより広がっていくと考えられます。<br />
: そこで私たちは、遺伝子組換えとはどういうことなのか、日本の、そして世界の多くの人に知ってもらうために、Human practiceにおいて次のような活動に取り組みました。<br />
<br />
== '''高校生向けの説明会''' ==<br />
==== 1.第一回オープンキャンパス (2010/08/10) ====<br />
: 高校生ならびにその保護者を対象にKIT-Kyotoのブースを設けました。<br />
: このブースではiGEMや、私たちの活動の紹介を行いました。高校生やその保護者の方が対象であるので、専門用語をできるだけ避け、できるだけ簡単な言葉で分かりやすい説明となるように心がけました。また、遺伝子組換え実験のモデル生物である酵母、カイコ、ショウジョウバエ、大腸菌の生体を展示しました。カイコに直接触れることのできるコーナーやショウジョウバエの遺伝子組換え系統の展示も行い、「何か得体の知れない物」という認識が強い遺伝子組換え技術に関して正しく理解でき、さらに親しみを覚えることができる展示となるようにしました。当日は約200人の高校生が訪れ、具体的なモデル生物を目の当たりにしてより生物学についてのイメージが膨らんできた等の意見を頂きました。<br />
<br />
:[[Image:KITOC1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2.jpg|150px]] [[Image:KITOC3.jpg|150px]] [[Image:KITOC4.jpg|150px]] [[Image:KITOC5.jpg|150px]]<br />
:Poster<br />
:[[Image:KITOC1.png|150px]] [[Image:KITOC2.png|150px]] [[Image:KITOC3.png|150px]]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
==== 2.第二回オープンキャンパス(2010/10/17) ====<br />
<br />
: 高校生やその保護者を対象にブースを設けました。今回は、前回の展示に加えて、コピックを用いた「E.coli pen」の試作版を実際に高校生に体験してもらい、化学と芸術の融合を楽しんでもらうことが出来ました。その他、大学見学に来た高校生への紹介活動も行っています。<br />
<br />
:[[Image:KITOC2-0.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-3.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-2.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-5.jpg|150px]]<br />
:[[Image:KITOC2-6.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-4.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-7.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-8.jpg|150px]] [[Image:KITOCPOSTER4.jpg|150px]]<br />
<br />
== KIT VL'''研究プロジェクト''' ==<br />
<br />
: KITベンチャーラボラトリーの「VL研究プロジェクト」に「E.coli pen」を出展しました。審査員である本学の様々な分野の先生方に、iGEMの目的や私たちのプロジェクトが目指すもの、E.coli penの設計図、完成予想図などを提出し、好意的な評価をいただくことができました。<BR><br />
:[http://www.vl.kit.jp/ja/project/2010.html >>京都工芸繊維大学ベンチャーラボラトリーへ]<br />
<br />
== iGEM Japan'''への参加、ならびにアンケート調査への参加''' ==<br />
<br />
: 私たちKIT-Kyotoは日本でのiGEMの知名度を高めるためにiGEM Japanに参加しています。iGEM Japanは日本のiGEM参加有志チームによる組織であり、各チームの連携を深めることによりiGEMをより活性化させるとともに、日本におけるiGEMの知名度を高めることを目的として活動しています。<br>私たちKIT-Kyoto以外にOsaka, Kyoto, Tokyo_Metropolitan, UT-Tokyo, Tokyo Tech, Sapporoの7チームが参加し、様々な活動を行っています。これまで日本でのプレ大会や雑誌への記事投稿などを行ないました。<br />
: また、大学生から一般市民までを広く対象にアンケート調査を行いました。この調査は、合成生物学が持つ生命倫理や安全性の問題について日本人がどのような考えやイメージを持っているのか調査するためのものです。調査した層については、学生では生物専攻の学生だけでなく、化学や情報、機械、芸術専攻の人にも調査し、調査対象が偏らないようにしています。また、上記の高校生対象の説明会などでもアンケートにご協力いただきました。他にもiGEM Japanで作成したWeb上の解答フォームからも解答できるようにし、多様な層の意見を集められるようにしました。<br />
<br />
<br />
'''遺伝子組換え/バイオテクノロジーについてのアンケート'''<br />
{| style="margin: 1em auto 1em auto" width="965px"<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!1. 普段買い物をする時、表示があれば「遺伝子組換えでない」食品を買いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 必ず買う ・ どちらかといえば買うことが多い ・ あまり気にしない ・ 全く気にしない ・ そのような表示を見たことがない 〕 <br />
<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!2.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)と聞いて、何を連想しますか? ※あてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;"<br />
|<br />
: 〔 クローン ・ 組換え作物(食品) ・ 特許 ・ DNA ・ ゲノム ・ 医薬品 ・ 化粧品 ・ 生命倫理 ・ ウィルス ・ 人工生命 ・ ノーベル賞 ・ 環境 ・ 生物兵器 ・ iPS細胞、ES細胞 ・ バイオ燃料 ・ バイオハザード ・ その他( ) 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!3. 効果に違いがないとすれば、(遺伝子組み換え技術/バイオテクノロジー)を用いて製造された医薬品についてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 使用することに全く抵抗はない ・ 使用することにあまり抵抗はない ・ 可能なら使用は避けたい ・ 絶対に使用は避けたい ・ 分からない 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!4.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)を用いて、天然の生物の遺伝子を人工的に変えることについてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 やってはいけないと思う ・ どちらかといえばやってはいけないと思う・ どちらかといえばやってもいいと思う ・ やってもいいと思う 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!5.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)についての情報は、否定的か肯定的、どちらが多く感じますか? <br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 否定的なものが多い ・ 同じぐらいである ・ 肯定的なものが多い ・ わからない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!6.日本は、積極的に(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に取り組んでいると思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 そう思う ・ ややそう思う ・ あまり思わない ・ 思わない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!7.「(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に関する研究」は、<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 続けた方がいい ・ 止めた方がいい 〕と思う。<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <続けた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 食糧問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 環境問題の解決につながる可能性があるから<br />
# エネルギー問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 医療への応用が期待できるから<br />
# 新しいビジネスになるから<br />
# 種の保存に利用できるから<br />
# 科学技術の発展を象徴しているから<br />
# すでに多くの国が実用化しているから<br />
# 将来性があるから<br />
# 学問として面白いから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <止めた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 環境や人間に有害な生物が生み出される可能性があるから<br />
# 生態系への影響が懸念されるから<br />
# 人体への影響が懸念されるから<br />
# 倫理的に受け付けないから<br />
# 世間が危険だと言っているから<br />
# 悪用されるかもしれないから<br />
# 法整備が不十分だから<br />
# 現在ある技術でも代用できるから<br />
# 将来性が他の研究に比べてなさそうだから<br />
#なんとなく不安だから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!8. 「合成生物学(Synthetic Biology)」という言葉を今までに聞いたことがありますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 はい ・ いいえ 〕<br />
|}<br />
<br />
==== 結果 ====<br />
: iGEM JAPANのHuman Practiceアンケート結果より、全体の半数以上の人が遺伝子組み換えやバイオテクノロジーに関する研究を続けるべきと考えていることがわかりました。しかし、遺伝子組み換えでない食品を買う傾向や遺伝子組み換え・バイオテクノロジーによって作られた医薬品を避ける傾向がありました。また遺伝子組み換え技術に関しては'''半数以上が否定的'''なイメージを持っていることがわかりました。<BR><br />
<br />
==== 考察 ====<br />
: 多くの人が遺伝子組み換えに関して漠然とした嫌悪感を抱いていると考えられます。研究を続けるべきと答えている人の多くが遺伝子組み換え技術を「食糧問題や医療技術へ応用」できると考えています。このことから遺伝子組み換えに関する知識があるとはいえます。しかし、メディアにより遺伝子組み換えに対して悪印象を持っていると思われます。これにより、遺伝子組み換え技術に対する理解と嫌悪という矛盾した意見の混合があると考えられます。これらは遺伝子組み換え技術の実態の不明瞭さが招いているものと考えられます。<BR><br />
<BR><br />
<br />
== '''未来の'''iGEM JAPAN'''チームへの貢献''' ==<br />
<br />
: 私たちはiGEMが推奨しているプロトコールを分かりやすく日本語化しました。また、日々の実験の記録を、実験のミス含め、目的から考察まで詳細に記述しました。今回私たちは、英語のLab noteだけでなく、より詳細なLab noteを日本語で作成しwikiで公開することにしました。この度あえて母国語のノートを作成したのは、私たちがLab noteにおいて大切とされる正確性をとても重要視しているためです。本来、実験ノートは、それを元にして実験を再現できる正確さ、詳細さを備えていなければなりません。これは、実験ノートに求められる非常に重要な要素です。しかし、これまでのiGEM参加チーム-特に非英語圏のチームのwikiでは、Lab noteの記入不足や表現の誤りなどが目立ち、この正確性を満たしているチームは非常に少ないのが実情です。私たちは今回のLab noteでこの正確性を満たすには、詳細をあえて母国語で書く事がベストであると判断し、このような形にしました。この形式は、今まで問題であったLab noteの正確性に対する一つの答えではないかと思います。また、こうして日本語で記入したノートを公開することにより、今後新たに参加する日本のチームの助けとなるでしょう。それがひいては日本におけるiGEMの知名度の向上につながると考えられます。<BR><br />
:[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/NotebookJ >>Lab Note へ]<br />
<br />
== '''他の'''iGEM team'''による調査への協力''' ==<br />
<br />
: 他のiGEMチームが行った調査に積極的に参加しました。これまでに参加した調査は下記のとおりです。<br />
:[[Team:Warsaw]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:METU_Turkey_Software]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Mexico-UNAM-CINVESTAV]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Edinburgh]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Freiburg_Bioware/NoteBook/Cuckoo_Clock]]: おもしろ写真コンテスト<br />
<html><body><div align="center"><br />
<embed type="application/x-shockwave-flash" src="http://picasaweb.google.com/s/c/bin/slideshow.swf" width="400" height="267" flashvars="host=picasaweb.google.com&hl=ja&feat=flashalbum&RGB=0x000000&feed=http%3A%2F%2Fpicasaweb.google.com%2Fdata%2Ffeed%2Fapi%2Fuser%2Fadbc963yk%2Falbumid%2F5532150873280077009%3Falt%3Drss%26kind%3Dphoto%26hl%3Dja" pluginspage="http://www.macromedia.com/go/getflashplayer"></embed></div><br />
</body></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/SafetyJTeam:KIT-Kyoto/SafetyJ2010-10-27T01:00:42Z<p>Drosuke: /* 回答 */</p>
<hr />
<div>{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/SafetyJ|Safety]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Safety |English]] / [[Team:KIT-Kyoto/SafetyJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<html><body><br />
<IMG SRC="https://static.igem.org/mediawiki/2010/7/7c/Labno.gif" onmouseover="this.src='https://static.igem.org/mediawiki/2010/b/be/BIOHAZARD.PNG'" onmouseout="this.src='https://static.igem.org/mediawiki/2010/7/7c/Labno.gif'" align="left"><br />
</body></html><br />
===質問事項===<br />
iGEM本部から、遺伝子組換え実験の安全性([[Safety]])に関する問題として、以下の4つの質問に答えるよう求められています。私たちの回答は以下の通りです。<BR><br />
<BR><br />
<br />
----<br />
<br />
===回答===<br />
'''Q. 今回のあなた方のプロジェクトにおいて、研究者や一般社会、環境への安全性について'''<BR><br />
'''なにか問題が起こりましたか?'''<br><br />
'''A.''' 私たちKIT-KyotoのiGEM 2010のプロジェクトにおいては、そのようないかなる安全性の問題も発生しませんでした。私たちの実験は全てbiosafety level 1に求められる安全基準に従って行われ、Rules of best microbiological practicesの要求を満たしています。<br><br />
また、私たちが今プロジェクトで提案する“''E.coli'' Pen”はH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による大腸菌殺菌機能を搭載しています。<br><br />
[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ#.E7.B5.90.E6.9E.9C.E3.81.A8.E8.80.83.E5.AF.9F >>活性酸素による大腸菌の生存への影響について]<br />
<br><br><br />
'''Q. あなた方が今回制作した新しいBioBrick partsにおいて、何か安全性に関する問題はありませんか?'''<br><br />
'''A.''' いいえ。今回私たちが開発したのは、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応性プロモーターによって蛍光タンパク質を発現させるパーツであり、完全に無害です。<br><br />
<br><br />
'''Q. Biosafetyに関する地区委員会のようなものはありましたか? その委員会からどのような評価を受けましたか?'''<br><br />
'''A.''' はい。私たちは、本学(京都工芸繊維大学)においてこのプロジェクトのbiosafetyに関するグループを立ち上げ、実験での安全性を監視しました。このグループの責任者は山口教授です。<br><br><br />
さらに、京都工芸繊維大学には、より上位の「遺伝子組換え実験等安全管理委員会」が設置されています。私たちは当委員会に実験計画の申請をし、承認を得ました。今実験で用いた試料は全て非汚染性、非感染性のものであり、biosafety level1に要求される安全基準に従っています。<br><br />
今回のプロジェクトでは、安全に実験を行うために、山口教授を始めとして多くのアドバイザー、インストラクターの方にサポートしていただきました。<br><br><br />
<br />
'''Q. 今後のiGEMのために、なにか有用なSafetyに関するアイディアはありませんか?'''<br><br />
'''A.''' 2つの提案があります。<br><br />
:1. "Best Safety"賞の創設。biosafetyに関する各チームの取り組みを評価し、取り組みが最も優秀であったと評価されたチームに"Best Safety"賞を授与する。<br><br />
:2. 銀メダルの獲得条件に「地区に存在する安全委員会に参加すること、地区に安全委員会がない場合は作ること」という項目を加える。<br><br><br />
<br />
<br />
<!--【キムワイプの中心で愛を叫ぶ -その4-】<br />
アクセス集中、リロード要求、数々の苦難を乗り越え、私はついに辿り着いた。<br />
この登録フォームさえ入力してしまえば、私はこの紙のスポーツ協会の仲間入りなのである。<br />
あと少し、この「あと少し」が待ち遠しくてたまらない。<br />
しかし募る思いは山より高く、一向に入力の手が緩む気配が感じられない。<br />
まさか、キムワイプへの愛がここで私を阻むことになろうとは夢にも思わなかった。--><br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T00:54:45Z<p>Drosuke: /* 諸論 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]]私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]]私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
:現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
:私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
::私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
::これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
::このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
::では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
::大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
::OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
::SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
:ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。できた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
:''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。<br />
しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
:また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
:以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断しました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。<br />
::桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
:参考文献より、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかる。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T00:53:31Z<p>Drosuke: /* 諸論 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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<br />
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</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]]私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]]私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
:現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
:私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
::私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
::これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
::このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
::では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
::大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
::OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
::SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpsB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
:ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。できた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの詳細に関しては下記のページをご覧ください。[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
:''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。<br />
しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
:また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
:以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断しました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。<br />
::桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
:参考文献より、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかる。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T00:52:55Z<p>Drosuke: /* 諸論 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]]私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]]私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
:現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
:私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
::私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
::これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
::このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
::では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
::大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
::OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
::SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpsB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
:ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。できた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。ペンの詳細に関しては下記のページをご覧ください。<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>デザインノートへ]<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
:''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。<br />
しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
:また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
:以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断しました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。<br />
::桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
:参考文献より、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかる。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJTeam:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ2010-10-27T00:50:29Z<p>Drosuke: /* 諸論 */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== '''要旨''' ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|145px]]私たちKIT-Kyotoは、新たなArt Toolとして「''E.coli'' Pen」を提案します。この''E.coli'' Penは大腸菌の菌液をインクとする全く新しいペンです。同じ一種類のインクで複数の色を創り出すことを最大の特徴とし、そのメカニズムには酸化ストレス応答機構を利用しています。私たちは、酸化ストレスを与えると蛍光タンパク質を発現する大腸菌を新たに作製しました。さらに、酸化ストレスへの応答が異なる様々なプロモーターを使ってそれぞれの下流域にある蛍光タンパク質の遺伝子発現の調節を行うことで、1種類の大腸菌に無限の色を作らせることに挑戦しました。私たちが作製したこのインクを用いた''E.coli'' Penを使えば、これまでのiGEMにおけるBioartとは一味違う、「一般の人」が親近感を持って、純粋にScienceとArtを楽しむことができるようになると期待しています。<br />
<br />
== '''諸論''' ==<br />
<br />
:[[Image:hatena.jpg|right|200px]]私たちKIT-Kyotoは、「科学をより身近に」というキーワードのもとにプロジェクトを進めてきました。<br />
:現在、理科離れは世界的に顕著な問題となっています。この傾向は、今後科学の発展に伴い、技術の高度化・複雑化が進めば進むほど強くなると予想されています。そこで、私たちはこのような問題を解決するために、普段、科学と接点のない人に科学に触れてもらう機会を提供しようと考えました。プロジェクトを進める上で、私たちが最も大切したのは、誰もが手軽に科学技術を楽しめるということです。さらに、本学(京都工芸繊維大学)の教育理念として「科学と芸術の出会い」すなわち、「科学」と「芸術」の2分野の融合というものが掲げられています。これらをヒントに私たちはバイオテクノロジーを用いて芸術作品を生み出す「バイオアート」に着目することにしました。<br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2">>>バイオアートとは……</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
バイオアートとは、この10年程での生物学の躍進によって生まれた、全く新しい種類の芸術です。主に生物学の研究者が、細胞、DNA、ゲノム、タンパク質、酵素などを素材として、ゲノムエンジニアリングや組織培養といった最先端テクノロジーによって作ります。<BR><br />
現在では、バイオアートでは「生きているもの(living forms)」を用いて作らなければならないと言う考え方が一般的です。しかし、この「生きているもの」の定義は、未だ明確に決まっていません。 このように、バイオアートはまだ生まれたばかりの新しい芸術なのです。<BR><br />
<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</body><br />
</html><br />
<br />
:<p>[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|既存のバイオアートの例(Wikipediaより引用)]]<br />
しかし、既存のバイオアートは、バイオテクノロジーなどの専門的な設備・知識が必要なために一般の人が身近に使うことのできるものではなく、私たちの「科学をより身近に」というキーワードに合致しません。そこで私たちは、バイオアートを手軽に楽しめる新しいアートツールの開発に取り組みました。<BR><br />
:私たちは、一つの大腸菌にインクとして作り出させた無数の色を持つ''E.coli'' Penという、今までにないアートツールを開発しました。この''E.coli'' Penは、新しいアートツールとしてバイオアートの分野を発展させるだけでなく、発色の美しさや絵を描く楽しさとともに生命現象のシステムも学ぶことができる知育玩具としても役立ちます。<BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br><br />
:''E.coli'' Penの開発については以下の項目に分けて詳細に述べます。<br />
'''1. どのようにして大腸菌に無数の色をつくらせるか?'''<br />
:'''1-1 光の三原色の利用'''<br />
::私たちは光の三原色(赤、緑、青)を利用することを考えました。色の素となるタンパク質には、蛍光タンパク質を使用しました。赤色はRFP、緑色はGFP、青色はCFPです。これらの蛍光タンパク質は紫外線を照射すると蛍光色を発し、レポーター遺伝子として遺伝子工学の分野ではすでに広く普及しています。これを用いて赤・緑・青の3色を大腸菌に作らせ、それぞれの色をつかさどるタンパク質の発現量を調節することにより、様々な比で赤・緑・青を混ぜ合わせ無数の色を作らせることができるのです。<br />
::これを実現するために図のような遺伝子を新たにデザインしました。<br />
<BR><br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<BR><br />
::このマルチ遺伝子カセットで、RFP(赤)、CFP(緑)、CFP(青)をコードする遺伝子は縦列関係にあり、それぞれの遺伝子は異なった活性を持つ異なったプロモーターによって制御されています。無数の色を作るするためには、これらの蛍光タンパク質を異なった比率で作り出されなければなりません。これは異なった活性を持つプロモーターを利用することによって達成できます。<br />
<br />
:'''1-2 適切なプロモーターの選択'''<br />
::では実際にどのようなプロモーターが適切なのでしょうか? 人為的に発現量を調節するには、刺激や誘引物質が必要です。刺激や誘引物質の中でも手軽に使用することが可能で、閾値をもつプロモーターが複数あるものを私たちは始めに考えました。さらに、iGEMで未だ扱われていないもの、将来の医療の向上にも役立つようなものという観点も加えて探索しました。そうして、今回タンパク質発現の調節に利用したのが活性酸素です。活性酸素は、好気性細胞の通常の酸素呼吸によって生じるものであり、反応性が高く酸化力が強いものです。そのために生体内で過剰に発生すると核酸・脂質・タンパク質と結合し酸化させ、生体成分に損傷を与えてしまいます。これは様々な疾患の原因と考えられています。しかし、好気性生物は進化の過程で酸素の有効利用を獲得するとともに、酸素の利用により発生する活性酸素への防御機構も獲得してきています。今回私たちが利用したのはその防御機構です。<br />
<br />
:'''1-3 過酸化水素応答のメカニズム'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
::大腸菌においても活性酸素に対する防御機構が存在しています。大腸菌には2通りの活性酸素への応答があります。一つはOxyR応答、もう一つはSoxRS応答です。<br />
<br />
::OxyR応答で、OxyRの遺伝子産物は転写調節因子として働いています。これは通常状態では不活化であり機能しませんが、活性酸素に応答して活性化し特定のDNA配列に結合するようになります。この特定のDNA配列はプロモーター領域に含まれます。OxyRの遺伝子産物が結合するとそのプロモーターの転写が促進あるいは抑制されてプロモーターの下流のタンパク質の発現が調節されます。このようなOxyRの遺伝子産物が結合する領域をもつプロモーターの下流にある遺伝子は活性酸素に対する防御遺伝子であり、活性酸素を分解するような活性酸素を減らす能力を持ちます。これらの遺伝子の中で、私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つahpC,dps.oxyR,sufA,yaiAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpSB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
::SoxR応答はOxyR応答同様に恒性的に合成されているタンパク質です。SoxRは、SoxSのプロモーター領域に結合し、転写を阻害しています。しかし過酸化水素を付加するとSoxRは活性化し、SoxSの転写を開始させます。合成されたSoxSは複数の遺伝子の転写因子として機能を獲得します。これらの遺伝子の中でも私たちは''Eco''RⅠ、''Xba''Ⅰ、''Spe''Ⅰ、''Pst''Ⅰによって切断されない遺伝子配列を持つacrAB,sodAのプロモーターに注目しました。これらの遺伝子のプロモーターをBiobrickサイトに記載されているpsB6A1にクローニングしました。<br />
<br />
:'''1-4 プロモーターについて'''<br />
::AcrAB ,AhpC,dps,OxyR, SodA ,SufA,YaiAの7つの活性酸素応答性プロモーターの中でも、ahpC,sufAの機能をここで簡潔に述べたいと思います。<br />
<br />
:::'''AhpCプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG1ahpcE.PNG]]<br />
::::ahpC-Fは酸化ストレス防御に関連する遺伝子です。これらの遺伝子の転写は過酸化水素応答によって制御されており、ahpCとahpFはアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の小サブユニットと大サブユニットを、それぞれコードしています。そしてAhpCとAhpFは複合体を形成することで、アルキルヒドロペルオキシドを還元します。ahpCプロモーターは酸化ストレス応答転写因子の1つであるOxyRによって支配されています。OxyRは恒性的に発現されるが、過酸化水素による酸化ストレス条件下において、初めて活性化されています。また活性型OxyRはahpCのプロモーター領域に結合し、転写を促進します。<br />
'''<br />
:::'''sufAプロモーター'''<br />
:[[Image:KTTAFIG2ahpcE.PNG]]<br />
::::sufAプロモーター;sufAプロモーターはOxyRを含めた幾つかの転写因子によって支配されており、それらの転写因子は大腸菌においてFe-S cluster assemblyシステムをコードするsufABCDSEオペロンの転写を制御しています。<br />
<br />
::これらと、活性酸素濃度と大腸菌の生存率について調べることで、私たちは大腸菌に無数の色を作り出せると考えました。<br />
<br />
'''2. 活性酸素と大腸菌を効率よく混ぜるペンをどう作るのか?'''<br />
:ノックの回数と強さによって、それぞれの溶液の抽出量を制御することで、''E.coli'' Penは大腸菌と過酸化水素の混合率を変化させ、様々な色を作り出すことができます。できた色が意図した色でなければ、どちらかの液を足してやることにより、従来のペンでは不可能であった微妙な色の調整も可能です。<br />
<BR><br />
<br />
== '''材料と方法''' ==<br />
<TABLE BORDER="0"><TR><br />
<TD>'''材料'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''株'''</TD><TR><br />
<TR><br />
<TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''プラスミド'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD>'''方法'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD COLSPAN="2">基本的なプロトコルを以下に示す。 詳細は各項目をクリック。</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''リスト'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> トランスフォーメーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アルカリミニプレップ</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 制限酵素処理</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> アガロースゲル電気泳動</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ゲルからのDNA抽出</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> ライゲーション</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> LB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> 2xYT培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOB培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><br />
<TD> SOC培地</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
== '''結果と考察''' ==<br />
<br />
<br />
=== 1. 活性酸素による大腸菌の生存曲線について ===<br />
'''<背景>'''<br />
:''E.coli'' Pen製作にあたって、''E.coli'' PenのインクにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系の大腸菌(DH5α)を用いました。<br />
しかし、高濃度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>は大腸菌に対して濃度依存的毒性を示すことが知られています。そこで、効率的にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>反応系を利用するために、大腸菌(DH5α)の生存曲線を調べ、大腸菌(DH5α)が死滅しない程度のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を求めることにしました。<br />
<br />
<br />
'''<実験方法>'''<br />
:'''1日目'''<br />
::・DH5αの培養<br />
:: プレートからシングルコロニーを滅菌した爪楊枝でピックアップしました。<br />
:: ↓爪楊枝でピックアップしたコロニーをテストチューブに入れた2mlのLB(amp-)液体培地に移し、37℃で振盪培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''2日目'''<br />
::前日にプレカルチャーした培養液2mlにLB液体培地 28mlを加えて希釈し、吸光度を計りました。<br />
::↓DH5αをO.D.600=0.4~0.6になるまで37℃で振盪培養しました。<br />
::↓培養後、培養液を2mlずつ分注し、終濃度が1mM,100μM,10μM,1μM,100nM,10nM,1nM, <br />
::100pM,10pM,1pMになるようにH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>を加え、37℃で振盪培養しました(1時間)。<br />
::↓1時間後、培養液1μlに対してLB液体培地を1ml加えて希釈し、希釈した培養液10μlをLBプレート(amp-)にまき、37℃で培養しました(overnight)。<br />
<br />
:'''3日目'''<br />
::プレートのコロニーの数を数え、生存曲線のグラフを作成しました。<br />
<br />
<br />
'''<実験結果>'''<br />
:実験結果を以下に示します。<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:得られたグラフより、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度は1mMである事がわかりました。一方、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が0.000001mM(=1nM)以下だと大腸菌の生存に影響を与えないことがわかりました。以上の結果からH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度が1nM~1mMの範囲を基準として使用し、次にH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>応答プロモーターの活性度合を調べることにしました。<br />
<br />
:また、この実験結果は実験を5回行って、その統計をもとにしているので実証性が十分にあるといえます。<br />
<br />
<br />
'''<引用文献>'''<br />
:以下の引用文献を参考に、得られた結果は正しいと判断しました。<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:図17Bは、大腸菌XL1-ブルーおよび0112a,c血清型の生存能力に対するH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>の濃度依存的毒性を示す。<br />
::桂川国際特許事務所「抗体または好中球を介するオゾン生成」(P2004-551020)<br />
<br />
:参考文献より、大腸菌のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>による致死濃度が1~0.9mMであること、ある一定のH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>濃度を超えると急激に大腸菌の生存率が下がることがわかる。<br />
<br />
=== 2. 適切なベクターの選択について ===<br />
:<I>E.coli</I> Penを作るにあたって、私たちは「インク」の選択を重要な問題だと考えました。文字を書いたり、絵を描くことに注目した<I>E.coli</I> PenはiGEM初の試みなので、「インク」(蛍光タンパク質)を生産するために適切なベクターを選択することから始めるべきだと考えたのです。「インク」には、長期間はっきりと書き続けられることが求められます。したがって、私たちは高い転写効率をもつ発現ベクターを選択することにしました。 <br />
:一般的に、タンパク質生産には低コピーベクターの方が高コピーベクターよりも適するとされています。しかしながら、iGEMに関連するどのようなサイトでもこの情報を見つけることができませんでした。そのため、今回私たちは高コピーベクターpSB1と低コピーベクターpSB6の性能を比較しました。<br />
<br><br />
:'''<結果>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>ベクター</td></tr><br />
::<tr><td align=center>蛍光強度</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(高コピーベクター)</td><td align=center>pSB6A1(低コピーベクター)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<考察>'''<br />
::低コピーベクターでは、明らかに高コピーベクターよりもGFPの転写効率が高いことが分かりました。<br />
::従って、私たちは蛍光タンパク質を作り出すために、低コピーベクター(pSB6A1)を選択しました。<br />
<br><br />
<br />
=== 3. 活性酸素の検出感度について ===<br />
<br />
=== 3-1.ahpC (BBa_K362001) ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:私たちは、ahpCプロモーターによる蛍光タンパク質発現系を設計し、この発現系ベクターをDH5αコンピテントセルに形質転換しました。そして、以下に示すように、過酸化水素を付加した細胞の蛍光強度測定を行いました。<br />
: 37℃下において、細胞を1nM~1mMの過酸化水素で処理し、10分毎に80分までの蛍光強度を測定しました。LB培地は自家蛍光が生じるため、対数増殖期にある大腸菌をOD600=0.5に保ち、PBSに懸濁しました。<br />
: Figure 1 はahpCプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答し、また経時的にその活性が増大していることを示しています。特に過酸化水素濃度10μM~1mM、処理後40分から70分において蛍光強度は著しく増大しました。また、処理後70分以降、蛍光強度の増大傾向は見られなくなりました。<br />
: 今回、私たちが得た結果は極めて理想的で、過酸化水素による濃度的、時間的な蛍光タンパク質の発現調節が可能であることを示唆しています。従って、私たちはこの発現系により、極めて多くの色をつくり得ると考えられます。私たちの発現システムは''E.coli'' Penの開発にとって、間違いなく強力なツールとなります。<br />
<br />
=== 3-2. sufA (BBa_K362005) ===<br />
<br />
<br />
'''<結果>'''<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
: 私たちはsufAプロモーターに関しても、蛍光タンパク質発現系を設計し、蛍光強度の測定を行いました。<br />
<br />
: Figure 2 はsufAプロモーターが過酸化水素に対して濃度依存的に応答していることを示しています。<br />
<br />
'''<考察>'''<br />
: sufAプロモーター領域はsufAオペロンの上流に位置し、SufAタンパク質は足場タンパク質として機能しています。SufAタンパク質は極めて短時間で発現量の最大値に達し、sufAプロモーターは少なくとも処理後、80分まではその活性を増大、維持しました。また私たちは、sufAプロモーターの濃度依存的な活性はSufAタンパク質の発現量にも反映されるものと推測しています。<br />
<br />
=== 4. インクの作製について ===<br />
<br />
'''<結果と考察>'''<br />
<br />
=== 4-1. 様々な色によるインクの作成 ===<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|図1.LBとPBSの自家蛍光について]]<br />
<BR>(A) PBS UV照射なし (B) LB UV照射なし(C) PBS UV 照射下 (D) LB培地 UV照射下<br />
<BR><br />
<br />
最初、私たちは溶媒としてLB培地を使用していましたが、インクの色がLB培地の高い自家蛍光によって明瞭ではありませんでした。よって、バイオアートによりよい溶媒を見つけるために、様々な溶媒を試してみました。図1はPBS とLB培地の比較を示しています。図1C,Dが示している通り、PBSはLB培地よりも低い自家蛍光を示しました。比べた結果、PBSが大腸菌の細胞に最良な溶媒であったので、PBSをE. coli ペンの溶媒としました。<br><br />
試行錯誤の結果、私たちは赤色やオレンジ色、黄色や緑色を作成することに成功しました。さらに、緑色と赤色を混ぜることで様々な色を作り出すことに成功しました。<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
: [[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|図2 黄色インクは赤色インクと緑色インクを混ぜることで作られる]]<BR><BR><BR><br />
<br />
(A)赤色インク、UV照射下でのRFP (B) 緑色インク、UV照射下でのGFP (C) 黄色インク、UV照射下でRFP:GFP比率1:2 <br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
緑色インクと赤色インクの作成には、psB6A1をベクターとして利用したK362001とpsB1C3をベクターとして利用したJ04450をそれぞれ使いました。そして、オレンジや黄色といった他の色のインクを作るために、緑色インクと赤色インクを混ぜました。黄色インクは赤色インクと緑色インクを1:2で混ぜることでできます(図2)。<br />
<br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|350px|図3 様々なバイオインク]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
(A)赤色インク (B)オレンジインク (C)黄色インク (D)緑色インク (E)PBS UV照射下<br />
<BR><BR><br />
また、オレンジ色は緑色インクと赤色インクを1:2の比率で混ぜることで作られます。この他にも、インクの混ぜる比率を変えることで様々な色を作ることができます。<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
=== 4-2. ''E.coli'' Penを用いた芸術作品について ===<br />
:最初、私たちは描くための用紙として新聞紙を使用しようと考えました。しかし、新聞紙は自家蛍光が強く、バイオアートには向かないとわかりました(図4)。実際、新聞紙の上にバイオインクで描いてみたところ、鮮明ではありませんでした。したがって、私たちはバイオアートに向いたよりよい用紙の探索をおこないました。図4が示す通り、研究室で一般的に使われているティッシュ、キムワイプは自家蛍光をほとんど持ちませんでした。では、なぜ用紙が自家蛍光を持つのでしょうか?よく知られているのはリグニンです。リグニンは木材が本来持っている成分であり、強い自家蛍光を持ちます。そして、いくつかの用紙はリグニンを豊富に含んでいます。この理由で、いくつかの用紙が強い自家蛍光を持ちます。一方でキムワイプは自家蛍光をほとんど持ちません。したがって、私たちは''E.coli'' ペンによるバイオアートのための用紙としてキムワイプが最良の物であるという結論に至りました。<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|図5 新聞紙とキムワイプの自家蛍光]]<BR><BR><br />
(A)新聞紙 (B)キムワイプ UV照射下 <br />
<br />
バイトインクとキムワイプを用いて、私たちはたくさんの絵や文章などを描きました。この後、示すのはいくつかの作品例です。新しいツールで生み出されたバイオアートは無限の可能性を秘めています。 <br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
図6 用紙上でのインク比較 <br />
1, インクなし 2, PBS 3, 緑インク 4, 黄色インク 5, オレンジインク 6, 赤インク (A) UV照射なし (B) UV照射下 ]]<br />
<BR><br />
:インクと用紙を使ってサンプルを作りました。次に示すのはそのサンプルです。<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|図7 楓]][[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|図8 竹]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|図 9 豊臣家 家紋]][[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|図10 梅]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|図11 桜]][[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|図12 蝶]]<br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|図13 石川五右衛門]][[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|図14 鯉]][[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|図15 白鳥]][[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|図16 銀杏]]<br />
<br />
</td></tr></table><br />
<br />
== '''参考文献''' ==<br />
<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] 布柴 達夫,大腸菌の活性酸素防御応答と突然変異誘発機構に関する研究,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] 武部 聡、東 恵実、吉田 恵、吉田 あや,cAMP-CRP制御系のsodAプロモーター活性に与える影響,京都女子大学食物學會誌,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,抗体または好中球を介するオゾン生成,2004 May 27.<br />
<br />
<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractTeam:KIT-Kyoto/Project/Abstract2010-10-27T00:43:21Z<p>Drosuke: /* 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector */</p>
<hr />
<div><html> <br />
<head> <br />
<script type="text/javascript"> <br />
var j$ = jQuery; <br />
<br />
j$(function(){ <br />
j$(".acc").each(function(){ <br />
j$("li > a", this).each(function(index){ <br />
var $this = j$(this); <br />
<br />
if(index=1) $this.next().hide(); <br />
<br />
$this.click(function(){ <br />
var params = {height:"toggle", opacity:"toggle"}; <br />
j$(this).next().animate(params).parent().siblings() <br />
.children("ul:visible").animate(params); <br />
return false; <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
}); <br />
</script> <br />
<br />
<style type="text/css"> <br />
{text-align: justify;}<br />
ul.acc, ul.acc li ul { <br />
width: 965px; <br />
margin: 0; <br />
padding: 0; <br />
list-style: none; <br />
} <br />
<br />
ul.acc a{ <br />
display: block; <br />
height: 30px; <br />
line-height: 30px; <br />
color: vlack; <br />
align:center<br />
} <br />
<br />
ul.acc { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
ul.acc li ul { <br />
background-color: transparent; <br />
} <br />
<br />
li.pon {<br />
float: left;<br />
}<br />
<br />
li.pon1 {<br />
float: left;<br />
hight: 500px;<br />
}<br />
</style> <br />
</head></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto/menu}}<br />
<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/Home|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|Project]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/Abstract|English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/AbstractJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
<br />
== Abstract ==<br />
:'''"''E.coli Pen''": Draw with your own color.'''<br />
:[[Image:ecolipen4.jpg|left|200px]]Our team, KIT-Kyoto suggests an “''E.coli'' Pen” as a new Art Tool. This brand-new pen uses no ink but medium in which genetically modified ''E.coli'' has been cultured. The Pen is able to express more than four colors in various intensities with single bacterial culture. This will be achieved by constructing plasmids carrying genes coding for four different fluorescent proteins under the control of seven promoters having different sensitivity to oxidative stress. The ''E.coli'' carrying these plasmids will produce different colors with various intensities by differentially responding to the gradient of hydrogen peroxide treatment. Different from previous passive BioArt in iGEM, the genetically engineered “''E.coli'' Pen” provides an active and wonderful tool for us to purely enjoy the Art having a feeling for biotechnology.<br />
<br />
== Introduction ==<br />
:::[[Image:hatena.jpg|right|200px]]Our team, KIT-Kyoto has designed and carried out the project taking account of the key word "Make the science and technology more accessible to the public". <BR><br />
:::Recently, it is getting more and more serious problem that people think that the science is too difficult to understand. Moreover, it is expected that people are moving away from the science as the science becomes more and more complicated. Therefore, to overcome such a problem, we would like to offer more opportunities for the public to interact with the science especially for the person who is not interested in the modern science. <BR><br />
:::In deciding our project, we thought it is the most important that anyone can readily enjoy the science and technology. We therefore decided to focus on "Bio art" in order to invent the artistic products by using biotechnology, since Art is more accessible to the public. Moreover, unifying the two apparently distant academic fields "Science" and "Art" is an educational philosophy of our University, Kyoto Institute of technology. <br />
<html><body><br />
<p style="width: 960px; margin:10px auto"> <br />
<ul class="acc" align="left"> <br />
<li><a href="#2"> >>Learn More BioArt</a> <br />
<ul class="fxmn" align=left> <br />
<p> A brand-new form of art has emerged with the revolution of biology in the last ten years, this is Bio-Art. Adding new artistic elements, such as cells, DNA, genomes, proteins, enzymes, etc., this new form of artistic expression has as medium living matter, and the studios of the artists are biological laboratories, while high end technologies of genetic engineering, tissue culture and many others are their new painting brushes.<br />
<p> BioArt is considered by most artists to be strictly limited to “living forms,” although there is some debate as to the stages at which matter can be considered to be alive or living. Creating living beings and practicing in the life sciences brings about ethical, social and aesthetic inquiry.<br />
<p> Here, we aim at a completely new style of BioArt. In hitherto BioArt, the appreciator enjoys a work in the conventional way, that is he/she appreciates an artist’s resulting piece looking or touching it. The new style of BioArt we propose here is the enjoyment of making art itself. With the “<i>E.coli</i> Pen” that we propose here the appreciator himself becomes part of the artistic work he is drawing enjoying the fascination of making the work and the work itself.<br />
</ul> <br />
</li><br />
</ul> <br />
</html><br />
:::[[Image:bioart.jpg|thumb|left|200px|Already existing BioArt:wikipedia]]However, an already existing bio art does not meet the key word “Make the science and technology more accessible”, because that the preexisting bio art needs special equipment and the deep knowledge of biotechnology etc. We therefore decided to work on the development of a new art tool by which people could enjoy the bio art easily. <BR><br />
:::Here we can propose a novel art tool, “''E.coli'' Pen” which draws paintings with innumerable colors as inks of the pen that are produced by a single <I>E. coli</I> bacteria. "<I>E.coli</I> Pen" would further develop the field of the bio art as a new art tool. Furthermore it is useful as an educational tool, since people can enjoy drawings with the heavenly color with happiness and at the same time they can study the molecular mechanism how the colors are made by genetic engineering.<br><br><br><br><br><br><br />
:We summarize how to make "''E.coli'' Pen" in the following section.<br />
:'''1. How to make an innumerable color in ''E. coli'' bacteria'''<br />
::'''1-1. Use of light's three primary colors'''<br />
:::Principle of light’s three primary colors (red, green, and blue) can be applied to create an innumerable color. The fluorescent protein can be used as a color source. Red Fluorescent Protein (RFP) can be used for Red, Green Fluorescent Protein (GFP) can be used for Green, and Cyan Fluorescent Protein (CFP) can be used for Blue. The color fluorescence is emitted when ultraviolet rays is irradiated. These fluorescent proteins are widely used in the field of the genetic engineering as the reporter gene. Therefore once we obtain the red, green, and blue fluorescent proteins in our hands, we can create an innumerable color by simply mixing these three fluorescent proteins with various ratios. At first we tried to produce the red, green, and blue fluorescent proteins in ''E. coli''. <br />
:::To achieve this, the multi-gene cassette shown in below was newly designed. <br />
<br />
[[Image:complex.jpg|700px|center|]]<br />
<br />
:::In this multi-gene cassette, the genes encoding RFP (Red), GFP (Green) and CFP (Blue) are placed in a tandem array. Each gene can be controlled by different promoter that has different activity. In order to create different color, fluorescent proteins have to be produced in different ratios. This can be achieved by utilizing promoters having different activities.TM is a terminator.<br />
<BR><br />
::'''1-2 Selection of an appropriate promoter'''<br />
:::Then, what kind of promoter is actually appropriate for this purpose? The promoter activity has to be controlled by some regulating substances. The easily available substance that had not been used before in iGEM would be suitable for the purpose. If the substance is related to some human diseases or aging, the promoter responding to the substance may be used for diagnosis of the disease or aging in future, since the fluorescent proteins under the control of the promoter can be used as markers. From these standpoints we decided to use promoters responding to hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide is one of the reactive oxygen species that oxidize nucleic acid, lipid and protein to result in aging of human cells and various diseases. Although effective use of oxygen is acquired during evolution, the defense system to the active oxygen generated by consumption of oxygen also has been acquired in the aerobe. There are a set of genes that are involved in this defense system. These genes can be induced by hydrogen peroxide. We have utilized the promoters of these genes to induce the fluorescent proteins. <br />
<BR><br />
::'''1-3 Mechanism of hydrogen peroxide response'''[[Image:OXIDATIVESTRESS.GIF|right]]<br />
:::''E. coli'' has two defense mechanisms against the active oxygen . One is OxyR response, and another is SoxRS response. <br />
:::In the OxyR response, OxyR works as a transcription factor. OxyR regulates activation or repression of the gene expression. Without active oxygen, OxyR is in an inactivated form. And with active oxygen, OxyR is activated and the activated OxyR can bind to the specific DNA sequence. OxyR binding sites are found in promoters of a set of genes that respond to the active oxygen. In these active oxygen response genes, we focused on the promoter of ''ahpC'', ''dps'', ''oxyR'', ''sufA'', and ''yaiA''. These genes carry no recognition sequences of ''EcoR''Ⅰ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰ,and ''Pst''Ⅰ restriction enzymes. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::In the SoxRS response, SoxR works as a transcription factor. SoxR is constantly expressed in cells. SoxR binds to the promoter of SoxS, and represses its transcription without hydrogen peroxide. With hydrogen peroxide, SoxR activates the SoxS gene transcription. SoxS also works as a transcription factor of two or more downstream genes responsible to the hydorogen peroxide. In these hydrogen peroxide response genes, we focused on the promoter of ''acrAB'' and ''sodA''. Both of these genes have no sequence of ''Eco''RⅠ, ''Xba''Ⅰ, ''Spe''Ⅰand ''Pst''Ⅰ restriction enzyme sites. These restriction enzyme sites would be used for cloning into the pSB1C3. The promoters of these two genes cloned into pSB6A1 are listed in our Biobrick site.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Parts >>Go to the article of our Biobrick site.]<br />
<br />
<BR><br />
::'''1-4 Active oxygen response promoters'''<br />
:::Out of these seven active oxygen response promoters, we here shows the structure of ahpC and sufA promoters. <br />
<BR><br />
:::'''ahpC promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG1ahpcEEE.PNG]]<br />
:::ahpC-F are the genes involved in oxidative stress defense. Transcription of these genes is regulated in response to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The ahpC and ahpF genes encode the small subunit and large subunit of alkyl hydroperoxide reductase, respectively. The complex of AhpC and AhpF reduces alkyl hydroperoxide. The ahpC-promoter is controlled by the OxyR protein, an oxidative stress responsive transcription factor. OxyR is constitutively expressed but activated only under oxidative stressed conditions caused by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>. The activated OxyR binds to the promoter region of the ahpC gene and promotes its transcription.<BR><br />
<BR><br />
:::'''sufA promoter'''<BR><br />
::[[Image:KTTAFIG2ahpcEEE.PNG]]<br />
:::sufA promoter is controlled by some transcription factors including OxyR, regulates the transcription of sufABCDSE operon encoding an alternative Fe-S cluster assembly system in ''E.coli''. We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<BR><br />
::'''2. How is the pen that efficiently mixes the active oxygen and ''E. coli'' made?'''<br />
:::The ''E.coli'' Pen changes the mixing rate for ''E. coli'' culture medium and hydrogen peroxide. The volume of each solution, placed in different tubes within the pen, can be regulated by the frequency and intensity of pressing the pen's piston which can be interchanged among both tubes. For example, to make red ink, one presses the pyston in the ''E. coli'' tube three times and then interchanges to the hydrogen peroxide tube and presses the piston twice. Or, to use green ink, press the'' E. coli'' tube five times and then the hydrogen peroxide tube only once. In this way, one is able to produce any color. This is a spectacular way of producing new colors that any conventional pen can not realize. The movie of the ''E.coli'' Pen is shown in the first page of wiki of our team.<br />
:::[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/DesignNote >>Go to the article of design note.]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
== Materials & Methods ==<br />
<TABLE BORDER="0"><br />
<TR><TD>'''Materials'''</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Strains'''</TD><TR><br />
<TR><TD> ''Esherichia coli''</TD><TD> DH5 Alpha</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Plasmids'''</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB3K3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB3K3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB6A1</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB6A1>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1C3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1C3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1A2</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1A2>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB1AK3</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB1AK3>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD> pSB4A5</TD><TD> [http://partsregistry.org/wiki/index.php/Part:pSB4A5>>get more information]</TD></TR><br />
<TR><TD>'''Methods'''</TD></TR><br />
<TR><TD COLSPAN="2">Our standard protocols are listed below. Please click each item for details.</TD></TR><br />
<TR><TD> '''List of protocols'''</TD></TR><br />
<TR><TD> Bacterial transformation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#tf >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA miniprep</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#al >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> PCR</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#pcr >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA digestion by restriction enzymes</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#re >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Agarose gel electrophoresis</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#agar >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> Isolation of DNA fragments from agarose gel</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#gel >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> DNA ligation</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lig >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> '''Culture media'''</TD></TR><br />
<TR><TD> LB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#lb >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> 2xYT culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#yt >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOB culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#sob >>Go protocol]</TD></TR><br />
<TR><TD> SOC culture medium</TD><TD> [https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Protocol#soc >>Go protocol]</TD></TR><br />
</TABLE><br />
<br />
<br><br />
<br />
== Results & Discussion ==<br />
<br />
=== 1. Susceptibility to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in ''Escherichia coli'' ===<br />
:In the ''E.coli'' Pen, we utilized the hydrogenperoxide (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)-responsive system of ''E.coli'' cells to make different colors. It is well known that H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> shows the concentration-dependent toxicity for ''E.coli'' cells. In order to determine the utilizable concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in the ''E.coli'' Pen, we monitored the susceptibility of ''E.coli'' cells (DH5 Alpha) against H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>.<br />
<br />
<br />
'''<Experiment method>''' <br />
:'''The 1st day evening ''' <br />
<br />
::Precultivation of DH5 Alpha cells <br />
::DH5 Alpha cells on a LB plate were picked up with the sterilized toothpick, inoculated into 2 ml of LB (amp-) medium in a test tube, and then precultured at 37˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 2nd day'''<br />
<br />
::Survival test<br />
::All of the precultured DH5 Alpha cells were transferred into 28 ml of a fresh LB (amp-) medium in a 100 ml Erlenmeyer flask. <br />
::↓<br />
::DH5 Alpha cells were cultivated at 37 ˚C until the optical density (OD600) of the medium became 0.4~0.6.<br />
::↓<br />
::The culture was equally dispensed (2 ml each) into sample tubes, and then cells were treated with various concentrations of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (final concentrations were as follows: 1 pM, 10 pM, 200 pM. 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1μM, 10μM, 100μM, and 1 mM) at 37 ˚C for 60 min.<br />
::↓<br />
::Samples were diluted by mixing 1 ml of fresh LB medium and 1μl of each sample.<br />
::↓<br />
::10 μl of the diluted sample was spread out on a LB plate (amp-) and incubated at 37 ˚C (overnight).<br />
<br />
:'''The 3rd day'''<br />
<br />
::The number of colonies on the plate was counted and made a graph of the survival curve.<br />
<br />
'''<Result>'''<br />
<br />
:[[Image:0826-生存曲線.jpg]]<br />
<br />
:Representative data from five independent experiments are shown.<br />
<br />
'''<Discussion>'''<br />
:As shown in the graph, 1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> was the lethal concentration for ''E.coli'' cells. On the other hand, less than 0.000001mM(=1nM) H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> has no influence on the survival of ''E.coli'' cells. These results suggest that a range of 1nM-1mM of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> is the utilizable concentration for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''<References>'''<br />
:Application serial number in Japan (P2004-551020) "Ozone generation goes through an antibody or neutrophile" by Novartis Akuchiengezerushafuto and the Scrips Res. Inst.<br />
<br />
:[[Image:0826-引用画像.jpg]]<br />
:Figure 17B shows the concentration of H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> dependent toxicity for the viability of ''E.coli'' XL1- blue and O112a, c serotype. Our data is supported by this reference.<br />
<br />
=== 2. Compare the performances of the high copy vector and low copy vector ===<br />
::In making the <I>E.coli</I> Pen, we thought that it was important to select “ink.” The ''E.coli'' Pen, which focused on writing or drawing, is a first attempt in iGEM, so we thought that we should start to select an appropriate vector to produce “ink”, fluorescent proteins. As “ink”, it is necessary to keep writing or drawing clearly over the long term, and we therefore selected an expression vector with high transcriptional efficiency.<br />
::In general, pSB6 is a low copy plasmid which makes it more suitable for protein production than the high copy vector. However this information cannot be found in any sites related to iGEM. Consequently, we tried to compare the performances of the high copy vector pSB1 and low copy vector pSB6.<br />
:'''<Result>'''<br />
::<table border=1><br />
::<tr><td>&nbsp;</td><td colspan=3 align=center>Vector</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Fluorescent intensity</td><td align=center>pSB1A2(promoter less GFP)</td><td align=center>pSB1A2(High Copy Vector)</td><td align=center>pSB6A1(Low Copy Vector)</td></tr><br />
::<tr><td align=center>1</td><td align=right>0.145</td><td align=right>0.349</td><td align=right>4.33</td></tr><br />
::<tr><td align=center>2</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.324</td><td align=right>4.34</td></tr><br />
::<tr><td align=center>3</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.328</td><td align=right>4.42</td></tr><br />
::<tr><td align=center>Ave</td><td align=right>0.146</td><td align=right>0.337</td><td align=right>4.36</td></tr></table><br />
<br><br />
::[[Image:g1.jpg]]<br />
:'''<Discussion>'''<br />
::Clearly the Low copy vector has much higher transcriptional efficiency of [GFP] than the High copy vector.<br />
::So we selected a Low copy vector (pSB6A1) to produce fluorescent proteins.<br />
<br />
=== 3. Constructing an expression system ===<br />
:We constructed an expression system in which the H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> responsible promoter controls the transcription of fluorescent protein genes on pSB6, and transformed this vector into DH5 Alpha competent cells. And, here we show an expressing system by using ahpC promoter and sufA promoter. We then examined the fluorescent intensity using the cells treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> as follows:<br />
<br />
'''<Experiment method>'''<br />
:''E.coli'' cells in the log-phase were treated with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> at 37℃. The fluorescent intensity was measured every 10 minutes until 80minutes. After the treatment with H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>, cells were suspended in PBS to obtain the initial OD600 = 0.5 because the LB medium has auto fluorescence, then the fluorescent intensity was measured using Thermo Labosystems Floreskan Ascent CF. <br />
<br />
'''3-1. ahpC (BBa_K362001) '''<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
<br />
:[[Image:AhpC.jpg|350px]]<br />
:Figure 1 indicates that the ahpC promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> in a dose-dependent manner and its activity increased with time. Especially, the treatment with 10 μM to 1mM H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> for 40 to 70 min increased the fluorescent intensity remarkably. After 70 min, the intensity decayed with time.<br />
'''<Discussion>'''<br />
:Our results seem quite reasonable and suggest a possibility that we can adjust the expression levels of fluorescent genes by H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> concentration and by time. Therefore, we expect that lots of colors can be created using this system. Our expression system must be a powerful tool for the construction of the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
'''3-2. sufA (BBa_K362005) '''<br />
<br />
'''<Results>'''<br />
:We also constructed expression systems in which the sufA promoter controls the transcription of fluorescent protein genes and measured the fluorescent intensity.<br />
<br />
<br />
:[[Image:SufA graph.jpg|350px]]<br />
:Figure 2 shows that the sufA promoter responded to H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> stress in a dose-dependent manner.<BR> <br />
'''<Discussion>'''<br />
:The sufA promoter region is located upstream of the sufA operon and SufA protein acts as an assembly scaffold. Since levels of SufA protein are maximized quite rapidly, the activity of the sufA promoter was increased and sustained for at least 80 min. We think that the concentration-dependent activation of the sufA promoter also reflects the levels of SufA protein.<br />
<br />
<br />
<BR><br />
<br />
=== 4. Making Inks ===<br />
<br />
:This section consists of two parts. The first one is about making inks with various colors. The other is the actual art works drawn using the inks we made. <br />
<br />
<br />
'''4-1. Making inks with various colors.'''<br />
<br />
:[[Image:KITfig1.png|thumb|left|319px|Fig. 1 Autofluorescence of LB medium and PBS.(A) PBS without UV light, (B) LB medium without UV light, (C) PBS under UV light, (D) LB medium under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<br />
<BR><br />
Although we initially used the LB medium as a solvent, the colors of inks were not so clear because LB medium has high levels of background fluorescence (autofluorescence). To find the proper solvent for BioArt, we tried out various solutions. Fig. 1 shows the comparison of autofluorescence between PBS buffer and LB medium. As shown in Figs. 1C and 1D, PBS buffer has lower levels of autofluorescence than LB medium. As far as we tried out, PBS buffer was one of the best solvent of ''E.coli'' cells and we adopted PBS buffer as the solvent for the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
<br />
We succeeded to make several ink colors such as Red ink, Orange ink, Yellow ink, and Green ink. Additionally, we succeeded to develop various colors by mixing the Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
:[[Image:KITfig2.png|thumb|left|220px|Fig. 2 Yellow is made by mixing Red ink and Green ink.(A)Red ink by RFP expression under UV light, (B) Green ink by GFP expression under UV light, (C) Yellow ink by mixing RFP:GFP=1:2 under UV light.]]<BR><BR><BR><br />
<BR><br />
<br />
<BR><BR><br />
To make Green ink and Red ink, we used K362001 on pSB6A1, a GFP expression vector, and J04450 on pSB1C3, RFP expression vector, respectively.<br />
Furthermore, we mixed Green ink and Red ink to make other colors such as Orange ink and Yellow ink. Fig. 2C shows one of a new color ink, Yellow, made by mixing equal amounts of Green ink and Red ink. <br />
<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig3.png|thumb|left|400px|Fig. 3 Various colors of our bio inks.(A)Red ink, (B) Orange ink, (C) Yellow ink ,(D)GFP ink, and (E)PBS under UV light.]]<br />
<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
To make Orange ink, we mixed Green ink and Red ink in a ratio of 1 : 2. Of course, we can create various colors by mixing inks in a various ratio. <br />
<br />
<br />
<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><br />
<br />
<br />
<br />
'''4-2. Art works with bio inks.'''<br />
<br />
:At first, we used newspaper as drawing papers. However, we found that newspaper has high levels of intrinsic fluorescence and is not suitable for BioArt (Fig. 4). Indeed, pictures drawn with bio inks on newspaper were dull and not clear. Therefore, we tried to find the proper paper for BioArt. As shown in Fig. 4, ‘‘Kimwipes’’, a type of cleaning tissue commonly used in laboratories, did not show almost any intrinsic fluorescence. Why do some papers have intrinsic fluorescence? It is well known that lignin, commonly derived from wood, has a strong intrinsic fluorescence, and some papers are rich in lignin. That is one of reasons why some papers showed high levels of intrinsic fluorescence. On the other hand, little lignin is contained in Kimwipes. Therefore, we concluded that Kimwipes is the best drawing papers for BioArt with the ''E.coli'' Pen.<br />
<br />
:[[Image:KITfig5.png|thumb|left|409px|Fig. 5 Intrinsic fluorescence of newspaper and Kimwipes. Newspaper (A) and Kimwipes (B) under UV light.]]<BR><BR><br />
<BR><br />
<BR><BR><br />
Using bio inks and Kimwipes, we drew and painted lots pictures, marks, letters, etc. Various examples of BioArt works are shown as follows. Please enjoy our art works !!!<br />
<BR><BR><BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
<br />
:[[Image:KITfig6.png|thumb|left|438px|Fig.6 <br />
Samples are as follows: 1, no ink; 2, PBS; 3, Green ink; 4, Yellow ink; 5, Orange ink; 6, Red ink. Samples were irradiated without UV light, (A) or with UV light (B). ]]<BR><BR><br />
<BR><BR><BR><br />
:We used these inks in order to make samples. Next figures shows some picture that we drew.<br />
<BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><BR><br />
<table><tr><td><br />
<div align="center">[[Image:KITfig7.png|left|thumb|274px|Fig. 7 Maple leaves]]<br />
<br />
[[Image:KITfig8.png|thumb|left|178px|Fig. 8 Bamboo]]</div><br />
<br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig9.png|thumb|left|314px|Fig. 9 Emblem of Samurai ,Toyotomi Hideyosi]]<br />
<br />
[[Image:KITfig10.png|thumb|left|296px|Fig. 10 Japanese plum]]<br />
<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig11.png|thumb|left|273px|Fig. 11 Cherry blossoms]]<br />
<br />
[[Image:KITfig12.png|thumb|left|341px|Fig. 12 Butterfly]]<br />
</div><br />
</td></tr><tr><td><br />
<div align="center"><br />
[[Image:KITfig13.png|thumb|left|236px|Fig. 13 Ishikawa Goemon]]<br />
<br />
[[Image:KITfig14.png|thumb|left|151px|Fig. 14 Carp]]<br />
<br />
[[Image:KITfig16.png|thumb|left|154px|Fig. 15 Crane ]]<br />
<br />
[[Image:KITfig17.png|thumb|left|169px|Fig. 16 Ginkgo]]<br />
</div><br />
</td></tr></table><br />
<br />
<BR><BR><br />
<br />
== References ==<br />
<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443092 PMID: 11443092] Ming Zheng, Xunde Wang, Bernard Doan, Karen A. Lewis, Thomas D. Schneider, Gisela Storz,Computation-Directed Identification of OxyR DNA Binding Sites in <I>Escherichia coli</I>,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4571-79.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10913087 PMID: 10913087] Urs A. Ochsner, Michel L. Vasil, Eyad Alsabbagh, Kislay Parvatiyar, Daniel Hassett,Role of the Pseudomonas aeruginosa oxyR-recG operon in oxidative stress defense and DNA repair: OxyR-dependent regulation of katB-ankB, ahpB, and ahpC-ahpF.,Journal of Bacteriology,2000 Aug;182(16):4533-44.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110001710476 NAID: 110001710476] Nunoshiba Tatsuo,Mechanisms for the oxidative stress response and oxidative mutagenesis in <I>Escherichia coli</I>.,Environmental mutagen research,2001 June 30;23(1):23-32.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12876288 PMID: 12876288] Laurent Loiseau, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, Laurence Nachin, Mare Fontecave, Frederie Barras,Biogenesis of Fe-S cluster by the bacterial Suf system: SufS and SufE form a new type of cysteine desulfurase.,The Journal of Biological Chemistry,2003 Oct 3;278(40):38352-9.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18849427 PMID: 18849427] Joon-Hee Lee, Won-Sik Yeo, Jung-Hye Roe,Induction of the sufA operon encoding Fe-S assembly proteins by superoxide generators and hydrogen peroxide: involvement of OxyR, IHF and an unidentified oxidant-responsive factor.,Molecular Microbiology,2008 Dec;190(24):8244-7.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16621810 PMID: 16621810] Ramakrishnan Balasubramanian, Gaozhong Shen, Donald A. Bryant, John H. Golbeck,Regulatory Roles for IscA and SufA in Iron Homeostasis and Redox Stress Responses in the Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.,Journal of Bacteriology,2006 May;188(9):3182-91.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11443091 PMID: 11443091] Zheng M, Wang X, Templeton LJ, Smulski DR, LaRossa RA, Storz G.,DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide.,Journal of Bacteriology,2001 Aug;183(15):4562-70.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12889026 PMID: 12889026] Lu C, Bentley WE, Rao G.,Comparisons of oxidative stress response genes in aerobic <I>Escherichia coli</I> fermentations.,Biotechnology and Bioengineering,2003 Sep 30;83(7):864-70.<br />
# [http://ci.nii.ac.jp/naid/110000056227 NAID: 110000056227] Takebe So, Azuma Megumi, Yoshida Megumi, Yoshida Aya,Effect of cAMP-CRP regulation on sodA promoter activity.,Kyoto Women's University food journal,1995 Dec 10;50:37-42.<br />
# [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10585871 PMID: 10585871] Mitsumoto A, Kim KR, Oshima G, Kunimoto M, Okawa K, Iwamatsu A, Nakagawa Y.,Glyoxalase I is a novel nitric-oxide-responsive protein.,The Biochemical journal,1999 Dec 15;344 Pt 3:837-44.<br />
# [http://www.ekouhou.net/%E6%8A%97%E4%BD%93%E3%81%BE%E3%81%9F%E3%81%AF%E5%A5%BD%E4%B8%AD%E7%90%83%E3%82%92%E4%BB%8B%E3%81%99%E3%82%8B%E3%82%AA%E3%82%BE%E3%83%B3%E7%94%9F%E6%88%90/disp-A,2006-506613.html PCT/EP2003/012710] Novartis, The Scripps Research Institute,Generation of ozone through antibody or neutrophil,2004 May 27.<br />
<br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJTeam:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ2010-10-27T00:25:38Z<p>Drosuke: /* 他のiGEM teamによる調査への協力 */</p>
<hr />
<div>{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Human Practice]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPractice |English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
== '''はじめに''' ==<br />
<br />
: 現在、国際的に理科離れが進んでおり、どのようにScience Communicationを図るのかが問題となっています。日本でもその傾向が見られ、特に合成生物学の主幹技術である遺伝子組換え技術においては、「何か怖いものだ」という認識が根強くあります。遺伝子組換えとはどういったことなのか正しい理解もされていないまま、遺伝子組換え食品などは市場から実質的に排除されてしまっているのが現状です。今後、合成生物学が発達していくに伴って、国際的にこうした問題がより広がっていくと考えられます。<br />
: そこで私たちは、遺伝子組換えとはどういうことなのか、日本の、そして世界の多くの人に知ってもらうために、Human practiceにおいて次のような活動に取り組みました。<br />
<br />
== '''高校生向けの説明会''' ==<br />
==== 1.第一回オープンキャンパス (2010/08/10) ====<br />
: 高校生ならびにその保護者を対象にKIT-Kyotoのブースを設けました。<br />
: このブースではiGEMや、私たちの活動の紹介を行いました。高校生やその保護者の方が対象であるので、専門用語をできるだけ避け、できるだけ簡単な言葉で分かりやすい説明となるように心がけました。また、遺伝子組換え実験のモデル生物である酵母、カイコ、ショウジョウバエ、大腸菌の生体を展示しました。カイコに直接触れることのできるコーナーやショウジョウバエの遺伝子組換え系統の展示も行い、「何か得体の知れない物」という認識が強い遺伝子組換え技術に関して正しく理解でき、さらに親しみを覚えることができる展示となるようにしました。当日は約200人の高校生が訪れ、具体的なモデル生物を目の当たりにしてより生物学についてのイメージが膨らんできた等の意見を頂きました。<br />
<br />
:[[Image:KITOC1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2.jpg|150px]] [[Image:KITOC3.jpg|150px]] [[Image:KITOC4.jpg|150px]] [[Image:KITOC5.jpg|150px]]<br />
:Poster<br />
:[[Image:KITOC1.png|150px]] [[Image:KITOC2.png|150px]] [[Image:KITOC3.png|150px]]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
==== 2.第二回オープンキャンパス(2010/10/17) ====<br />
<br />
: 高校生やその保護者を対象にブースを設けました。今回は、前回の展示に加えて、コピックを用いた「E.coli pen」の試作版を実際に高校生に体験してもらい、化学と芸術の融合を楽しんでもらうことが出来ました。その他、大学見学に来た高校生への紹介活動も行っています。<br />
<br />
:[[Image:KITOC2-0.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-3.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-2.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-5.jpg|150px]]<br />
:[[Image:KITOC2-6.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-4.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-7.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-8.jpg|150px]] [[Image:KITOCPOSTER4.jpg|150px]]<br />
<br />
== KIT VL'''研究プロジェクト''' ==<br />
<br />
: KITベンチャーラボラトリーの「VL研究プロジェクト」に「E.coli pen」を出展しました。審査員である本学の様々な分野の先生方に、iGEMの目的や私たちのプロジェクトが目指すもの、E.coli penの設計図、完成予想図などを提出し、好意的な評価をいただくことができました。<BR><br />
:[http://www.vl.kit.jp/ja/project/2010.html >>the University Venture Business desk at KIT]<br />
<br />
== iGEM Japan'''への参加、ならびにアンケート調査への参加''' ==<br />
<br />
: 私たちKIT-Kyotoは日本でのiGEMの知名度を高めるためにiGEM Japanに参加しています。iGEM Japanは日本のiGEM参加有志チームによる組織であり、各チームの連携を深めることによりiGEMをより活性化させるとともに、日本におけるiGEMの知名度を高めることを目的として活動しています。<br>私たちKIT-Kyoto以外にOsaka, Kyoto, Tokyo_Metropolitan, UT-Tokyo, Tokyo Tech, Sapporoの7チームが参加し、様々な活動を行っています。これまで日本でのプレ大会や雑誌への記事投稿などを行ないました。<br />
: また、大学生から一般市民までを広く対象にアンケート調査を行いました。この調査は、合成生物学が持つ生命倫理や安全性の問題について日本人がどのような考えやイメージを持っているのか調査するためのものです。調査した層については、学生では生物専攻の学生だけでなく、化学や情報、機械、芸術専攻の人にも調査し、調査対象が偏らないようにしています。また、上記の高校生対象の説明会などでもアンケートにご協力いただきました。他にもiGEM Japanで作成したWeb上の解答フォームからも解答できるようにし、多様な層の意見を集められるようにしました。<br />
<br />
<br />
'''遺伝子組換え/バイオテクノロジーについてのアンケート'''<br />
{| style="margin: 1em auto 1em auto" width="965px"<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!1. 普段買い物をする時、表示があれば「遺伝子組換えでない」食品を買いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 必ず買う ・ どちらかといえば買うことが多い ・ あまり気にしない ・ 全く気にしない ・ そのような表示を見たことがない 〕 <br />
<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!2.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)と聞いて、何を連想しますか? ※あてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;"<br />
|<br />
: 〔 クローン ・ 組換え作物(食品) ・ 特許 ・ DNA ・ ゲノム ・ 医薬品 ・ 化粧品 ・ 生命倫理 ・ ウィルス ・ 人工生命 ・ ノーベル賞 ・ 環境 ・ 生物兵器 ・ iPS細胞、ES細胞 ・ バイオ燃料 ・ バイオハザード ・ その他( ) 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!3. 効果に違いがないとすれば、(遺伝子組み換え技術/バイオテクノロジー)を用いて製造された医薬品についてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 使用することに全く抵抗はない ・ 使用することにあまり抵抗はない ・ 可能なら使用は避けたい ・ 絶対に使用は避けたい ・ 分からない 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!4.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)を用いて、天然の生物の遺伝子を人工的に変えることについてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 やってはいけないと思う ・ どちらかといえばやってはいけないと思う・ どちらかといえばやってもいいと思う ・ やってもいいと思う 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!5.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)についての情報は、否定的か肯定的、どちらが多く感じますか? <br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 否定的なものが多い ・ 同じぐらいである ・ 肯定的なものが多い ・ わからない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!6.日本は、積極的に(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に取り組んでいると思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 そう思う ・ ややそう思う ・ あまり思わない ・ 思わない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!7.「(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に関する研究」は、<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 続けた方がいい ・ 止めた方がいい 〕と思う。<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <続けた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 食糧問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 環境問題の解決につながる可能性があるから<br />
# エネルギー問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 医療への応用が期待できるから<br />
# 新しいビジネスになるから<br />
# 種の保存に利用できるから<br />
# 科学技術の発展を象徴しているから<br />
# すでに多くの国が実用化しているから<br />
# 将来性があるから<br />
# 学問として面白いから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <止めた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 環境や人間に有害な生物が生み出される可能性があるから<br />
# 生態系への影響が懸念されるから<br />
# 人体への影響が懸念されるから<br />
# 倫理的に受け付けないから<br />
# 世間が危険だと言っているから<br />
# 悪用されるかもしれないから<br />
# 法整備が不十分だから<br />
# 現在ある技術でも代用できるから<br />
# 将来性が他の研究に比べてなさそうだから<br />
#なんとなく不安だから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!8. 「合成生物学(Synthetic Biology)」という言葉を今までに聞いたことがありますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 はい ・ いいえ 〕<br />
|}<br />
<br />
==== 結果 ====<br />
: iGEM JAPANのHuman Practiceアンケート結果より、全体の半数以上の人が遺伝子組み換えやバイオテクノロジーに関する研究を続けるべきと考えていることがわかりました。しかし、遺伝子組み換えでない食品を買う傾向や遺伝子組み換え・バイオテクノロジーによって作られた医薬品を避ける傾向がありました。また遺伝子組み換え技術に関しては'''半数以上が否定的'''なイメージを持っていることがわかりました。<BR><br />
<br />
==== 考察 ====<br />
: 多くの人が遺伝子組み換えに関して漠然とした嫌悪感を抱いていると考えられます。研究を続けるべきと答えている人の多くが遺伝子組み換え技術を「食糧問題や医療技術へ応用」できると考えています。このことから遺伝子組み換えに関する知識があるとはいえます。しかし、メディアにより遺伝子組み換えに対して悪印象を持っていると思われます。これにより、遺伝子組み換え技術に対する理解と嫌悪という矛盾した意見の混合があると考えられます。これらは遺伝子組み換え技術の実態の不明瞭さが招いているものと考えられます。<BR><br />
<BR><br />
<br />
== '''未来の'''iGEM JAPAN'''チームへの貢献''' ==<br />
<br />
: 私たちはiGEMが推奨しているプロトコールを分かりやすく日本語化しました。また、日々の実験の記録を、実験のミス含め、目的から考察まで詳細に記述しました。今回私たちは、英語のLab noteだけでなく、より詳細なLab noteを日本語で作成しwikiで公開することにしました。この度あえて母国語のノートを作成したのは、私たちがLab noteにおいて大切とされる正確性をとても重要視しているためです。本来、実験ノートは、それを元にして実験を再現できる正確さ、詳細さを備えていなければなりません。これは、実験ノートに求められる非常に重要な要素です。しかし、これまでのiGEM参加チーム-特に非英語圏のチームのwikiでは、Lab noteの記入不足や表現の誤りなどが目立ち、この正確性を満たしているチームは非常に少ないのが実情です。私たちは今回のLab noteでこの正確性を満たすには、詳細をあえて母国語で書く事がベストであると判断し、このような形にしました。この形式は、今まで問題であったLab noteの正確性に対する一つの答えではないかと思います。また、こうして日本語で記入したノートを公開することにより、今後新たに参加する日本のチームの助けとなるでしょう。それがひいては日本におけるiGEMの知名度の向上につながると考えられます。<BR><br />
:[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/NotebookJ >>Lab Note へ]<br />
<br />
== '''他の'''iGEM team'''による調査への協力''' ==<br />
<br />
: 他のiGEMチームが行った調査に積極的に参加しました。これまでに参加した調査は下記のとおりです。<br />
:[[Team:Warsaw]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:METU_Turkey_Software]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Mexico-UNAM-CINVESTAV]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Edinburgh]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Freiburg_Bioware/NoteBook/Cuckoo_Clock]]: おもしろ写真コンテスト<br />
<html><body><div align="center"><br />
<embed type="application/x-shockwave-flash" src="http://picasaweb.google.com/s/c/bin/slideshow.swf" width="400" height="267" flashvars="host=picasaweb.google.com&hl=ja&feat=flashalbum&RGB=0x000000&feed=http%3A%2F%2Fpicasaweb.google.com%2Fdata%2Ffeed%2Fapi%2Fuser%2Fadbc963yk%2Falbumid%2F5532150873280077009%3Falt%3Drss%26kind%3Dphoto%26hl%3Dja" pluginspage="http://www.macromedia.com/go/getflashplayer"></embed></div><br />
</body></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJTeam:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ2010-10-27T00:25:07Z<p>Drosuke: /* 考察 */</p>
<hr />
<div>{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Human Practice]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPractice |English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
== '''はじめに''' ==<br />
<br />
: 現在、国際的に理科離れが進んでおり、どのようにScience Communicationを図るのかが問題となっています。日本でもその傾向が見られ、特に合成生物学の主幹技術である遺伝子組換え技術においては、「何か怖いものだ」という認識が根強くあります。遺伝子組換えとはどういったことなのか正しい理解もされていないまま、遺伝子組換え食品などは市場から実質的に排除されてしまっているのが現状です。今後、合成生物学が発達していくに伴って、国際的にこうした問題がより広がっていくと考えられます。<br />
: そこで私たちは、遺伝子組換えとはどういうことなのか、日本の、そして世界の多くの人に知ってもらうために、Human practiceにおいて次のような活動に取り組みました。<br />
<br />
== '''高校生向けの説明会''' ==<br />
==== 1.第一回オープンキャンパス (2010/08/10) ====<br />
: 高校生ならびにその保護者を対象にKIT-Kyotoのブースを設けました。<br />
: このブースではiGEMや、私たちの活動の紹介を行いました。高校生やその保護者の方が対象であるので、専門用語をできるだけ避け、できるだけ簡単な言葉で分かりやすい説明となるように心がけました。また、遺伝子組換え実験のモデル生物である酵母、カイコ、ショウジョウバエ、大腸菌の生体を展示しました。カイコに直接触れることのできるコーナーやショウジョウバエの遺伝子組換え系統の展示も行い、「何か得体の知れない物」という認識が強い遺伝子組換え技術に関して正しく理解でき、さらに親しみを覚えることができる展示となるようにしました。当日は約200人の高校生が訪れ、具体的なモデル生物を目の当たりにしてより生物学についてのイメージが膨らんできた等の意見を頂きました。<br />
<br />
:[[Image:KITOC1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2.jpg|150px]] [[Image:KITOC3.jpg|150px]] [[Image:KITOC4.jpg|150px]] [[Image:KITOC5.jpg|150px]]<br />
:Poster<br />
:[[Image:KITOC1.png|150px]] [[Image:KITOC2.png|150px]] [[Image:KITOC3.png|150px]]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
==== 2.第二回オープンキャンパス(2010/10/17) ====<br />
<br />
: 高校生やその保護者を対象にブースを設けました。今回は、前回の展示に加えて、コピックを用いた「E.coli pen」の試作版を実際に高校生に体験してもらい、化学と芸術の融合を楽しんでもらうことが出来ました。その他、大学見学に来た高校生への紹介活動も行っています。<br />
<br />
:[[Image:KITOC2-0.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-3.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-2.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-5.jpg|150px]]<br />
:[[Image:KITOC2-6.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-4.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-7.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-8.jpg|150px]] [[Image:KITOCPOSTER4.jpg|150px]]<br />
<br />
== KIT VL'''研究プロジェクト''' ==<br />
<br />
: KITベンチャーラボラトリーの「VL研究プロジェクト」に「E.coli pen」を出展しました。審査員である本学の様々な分野の先生方に、iGEMの目的や私たちのプロジェクトが目指すもの、E.coli penの設計図、完成予想図などを提出し、好意的な評価をいただくことができました。<BR><br />
:[http://www.vl.kit.jp/ja/project/2010.html >>the University Venture Business desk at KIT]<br />
<br />
== iGEM Japan'''への参加、ならびにアンケート調査への参加''' ==<br />
<br />
: 私たちKIT-Kyotoは日本でのiGEMの知名度を高めるためにiGEM Japanに参加しています。iGEM Japanは日本のiGEM参加有志チームによる組織であり、各チームの連携を深めることによりiGEMをより活性化させるとともに、日本におけるiGEMの知名度を高めることを目的として活動しています。<br>私たちKIT-Kyoto以外にOsaka, Kyoto, Tokyo_Metropolitan, UT-Tokyo, Tokyo Tech, Sapporoの7チームが参加し、様々な活動を行っています。これまで日本でのプレ大会や雑誌への記事投稿などを行ないました。<br />
: また、大学生から一般市民までを広く対象にアンケート調査を行いました。この調査は、合成生物学が持つ生命倫理や安全性の問題について日本人がどのような考えやイメージを持っているのか調査するためのものです。調査した層については、学生では生物専攻の学生だけでなく、化学や情報、機械、芸術専攻の人にも調査し、調査対象が偏らないようにしています。また、上記の高校生対象の説明会などでもアンケートにご協力いただきました。他にもiGEM Japanで作成したWeb上の解答フォームからも解答できるようにし、多様な層の意見を集められるようにしました。<br />
<br />
<br />
'''遺伝子組換え/バイオテクノロジーについてのアンケート'''<br />
{| style="margin: 1em auto 1em auto" width="965px"<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!1. 普段買い物をする時、表示があれば「遺伝子組換えでない」食品を買いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 必ず買う ・ どちらかといえば買うことが多い ・ あまり気にしない ・ 全く気にしない ・ そのような表示を見たことがない 〕 <br />
<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!2.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)と聞いて、何を連想しますか? ※あてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;"<br />
|<br />
: 〔 クローン ・ 組換え作物(食品) ・ 特許 ・ DNA ・ ゲノム ・ 医薬品 ・ 化粧品 ・ 生命倫理 ・ ウィルス ・ 人工生命 ・ ノーベル賞 ・ 環境 ・ 生物兵器 ・ iPS細胞、ES細胞 ・ バイオ燃料 ・ バイオハザード ・ その他( ) 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!3. 効果に違いがないとすれば、(遺伝子組み換え技術/バイオテクノロジー)を用いて製造された医薬品についてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 使用することに全く抵抗はない ・ 使用することにあまり抵抗はない ・ 可能なら使用は避けたい ・ 絶対に使用は避けたい ・ 分からない 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!4.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)を用いて、天然の生物の遺伝子を人工的に変えることについてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 やってはいけないと思う ・ どちらかといえばやってはいけないと思う・ どちらかといえばやってもいいと思う ・ やってもいいと思う 〕<br />
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|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!5.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)についての情報は、否定的か肯定的、どちらが多く感じますか? <br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 否定的なものが多い ・ 同じぐらいである ・ 肯定的なものが多い ・ わからない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!6.日本は、積極的に(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に取り組んでいると思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 そう思う ・ ややそう思う ・ あまり思わない ・ 思わない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!7.「(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に関する研究」は、<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 続けた方がいい ・ 止めた方がいい 〕と思う。<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <続けた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 食糧問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 環境問題の解決につながる可能性があるから<br />
# エネルギー問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 医療への応用が期待できるから<br />
# 新しいビジネスになるから<br />
# 種の保存に利用できるから<br />
# 科学技術の発展を象徴しているから<br />
# すでに多くの国が実用化しているから<br />
# 将来性があるから<br />
# 学問として面白いから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <止めた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 環境や人間に有害な生物が生み出される可能性があるから<br />
# 生態系への影響が懸念されるから<br />
# 人体への影響が懸念されるから<br />
# 倫理的に受け付けないから<br />
# 世間が危険だと言っているから<br />
# 悪用されるかもしれないから<br />
# 法整備が不十分だから<br />
# 現在ある技術でも代用できるから<br />
# 将来性が他の研究に比べてなさそうだから<br />
#なんとなく不安だから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!8. 「合成生物学(Synthetic Biology)」という言葉を今までに聞いたことがありますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 はい ・ いいえ 〕<br />
|}<br />
<br />
==== 結果 ====<br />
: iGEM JAPANのHuman Practiceアンケート結果より、全体の半数以上の人が遺伝子組み換えやバイオテクノロジーに関する研究を続けるべきと考えていることがわかりました。しかし、遺伝子組み換えでない食品を買う傾向や遺伝子組み換え・バイオテクノロジーによって作られた医薬品を避ける傾向がありました。また遺伝子組み換え技術に関しては'''半数以上が否定的'''なイメージを持っていることがわかりました。<BR><br />
<br />
==== 考察 ====<br />
: 多くの人が遺伝子組み換えに関して漠然とした嫌悪感を抱いていると考えられます。研究を続けるべきと答えている人の多くが遺伝子組み換え技術を「食糧問題や医療技術へ応用」できると考えています。このことから遺伝子組み換えに関する知識があるとはいえます。しかし、メディアにより遺伝子組み換えに対して悪印象を持っていると思われます。これにより、遺伝子組み換え技術に対する理解と嫌悪という矛盾した意見の混合があると考えられます。これらは遺伝子組み換え技術の実態の不明瞭さが招いているものと考えられます。<BR><br />
<BR><br />
<br />
== '''未来の'''iGEM JAPAN'''チームへの貢献''' ==<br />
<br />
: 私たちはiGEMが推奨しているプロトコールを分かりやすく日本語化しました。また、日々の実験の記録を、実験のミス含め、目的から考察まで詳細に記述しました。今回私たちは、英語のLab noteだけでなく、より詳細なLab noteを日本語で作成しwikiで公開することにしました。この度あえて母国語のノートを作成したのは、私たちがLab noteにおいて大切とされる正確性をとても重要視しているためです。本来、実験ノートは、それを元にして実験を再現できる正確さ、詳細さを備えていなければなりません。これは、実験ノートに求められる非常に重要な要素です。しかし、これまでのiGEM参加チーム-特に非英語圏のチームのwikiでは、Lab noteの記入不足や表現の誤りなどが目立ち、この正確性を満たしているチームは非常に少ないのが実情です。私たちは今回のLab noteでこの正確性を満たすには、詳細をあえて母国語で書く事がベストであると判断し、このような形にしました。この形式は、今まで問題であったLab noteの正確性に対する一つの答えではないかと思います。また、こうして日本語で記入したノートを公開することにより、今後新たに参加する日本のチームの助けとなるでしょう。それがひいては日本におけるiGEMの知名度の向上につながると考えられます。<BR><br />
:[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/NotebookJ >>Lab Note へ]<br />
<br />
== '''他の'''iGEM team'''による調査への協力''' ==<br />
<br />
他のiGEMチームが行った調査に積極的に参加しました。これまでに参加した調査は下記のとおりです。<br />
:[[Team:Warsaw]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:METU_Turkey_Software]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Mexico-UNAM-CINVESTAV]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Edinburgh]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Freiburg_Bioware/NoteBook/Cuckoo_Clock]]: おもしろ写真コンテスト<br />
<html><body><div align="center"><br />
<embed type="application/x-shockwave-flash" src="http://picasaweb.google.com/s/c/bin/slideshow.swf" width="400" height="267" flashvars="host=picasaweb.google.com&hl=ja&feat=flashalbum&RGB=0x000000&feed=http%3A%2F%2Fpicasaweb.google.com%2Fdata%2Ffeed%2Fapi%2Fuser%2Fadbc963yk%2Falbumid%2F5532150873280077009%3Falt%3Drss%26kind%3Dphoto%26hl%3Dja" pluginspage="http://www.macromedia.com/go/getflashplayer"></embed></div><br />
</body></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJTeam:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ2010-10-27T00:24:49Z<p>Drosuke: /* 結果 */</p>
<hr />
<div>{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Human Practice]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPractice |English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
== '''はじめに''' ==<br />
<br />
: 現在、国際的に理科離れが進んでおり、どのようにScience Communicationを図るのかが問題となっています。日本でもその傾向が見られ、特に合成生物学の主幹技術である遺伝子組換え技術においては、「何か怖いものだ」という認識が根強くあります。遺伝子組換えとはどういったことなのか正しい理解もされていないまま、遺伝子組換え食品などは市場から実質的に排除されてしまっているのが現状です。今後、合成生物学が発達していくに伴って、国際的にこうした問題がより広がっていくと考えられます。<br />
: そこで私たちは、遺伝子組換えとはどういうことなのか、日本の、そして世界の多くの人に知ってもらうために、Human practiceにおいて次のような活動に取り組みました。<br />
<br />
== '''高校生向けの説明会''' ==<br />
==== 1.第一回オープンキャンパス (2010/08/10) ====<br />
: 高校生ならびにその保護者を対象にKIT-Kyotoのブースを設けました。<br />
: このブースではiGEMや、私たちの活動の紹介を行いました。高校生やその保護者の方が対象であるので、専門用語をできるだけ避け、できるだけ簡単な言葉で分かりやすい説明となるように心がけました。また、遺伝子組換え実験のモデル生物である酵母、カイコ、ショウジョウバエ、大腸菌の生体を展示しました。カイコに直接触れることのできるコーナーやショウジョウバエの遺伝子組換え系統の展示も行い、「何か得体の知れない物」という認識が強い遺伝子組換え技術に関して正しく理解でき、さらに親しみを覚えることができる展示となるようにしました。当日は約200人の高校生が訪れ、具体的なモデル生物を目の当たりにしてより生物学についてのイメージが膨らんできた等の意見を頂きました。<br />
<br />
:[[Image:KITOC1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2.jpg|150px]] [[Image:KITOC3.jpg|150px]] [[Image:KITOC4.jpg|150px]] [[Image:KITOC5.jpg|150px]]<br />
:Poster<br />
:[[Image:KITOC1.png|150px]] [[Image:KITOC2.png|150px]] [[Image:KITOC3.png|150px]]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
==== 2.第二回オープンキャンパス(2010/10/17) ====<br />
<br />
: 高校生やその保護者を対象にブースを設けました。今回は、前回の展示に加えて、コピックを用いた「E.coli pen」の試作版を実際に高校生に体験してもらい、化学と芸術の融合を楽しんでもらうことが出来ました。その他、大学見学に来た高校生への紹介活動も行っています。<br />
<br />
:[[Image:KITOC2-0.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-3.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-2.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-5.jpg|150px]]<br />
:[[Image:KITOC2-6.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-4.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-7.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-8.jpg|150px]] [[Image:KITOCPOSTER4.jpg|150px]]<br />
<br />
== KIT VL'''研究プロジェクト''' ==<br />
<br />
: KITベンチャーラボラトリーの「VL研究プロジェクト」に「E.coli pen」を出展しました。審査員である本学の様々な分野の先生方に、iGEMの目的や私たちのプロジェクトが目指すもの、E.coli penの設計図、完成予想図などを提出し、好意的な評価をいただくことができました。<BR><br />
:[http://www.vl.kit.jp/ja/project/2010.html >>the University Venture Business desk at KIT]<br />
<br />
== iGEM Japan'''への参加、ならびにアンケート調査への参加''' ==<br />
<br />
: 私たちKIT-Kyotoは日本でのiGEMの知名度を高めるためにiGEM Japanに参加しています。iGEM Japanは日本のiGEM参加有志チームによる組織であり、各チームの連携を深めることによりiGEMをより活性化させるとともに、日本におけるiGEMの知名度を高めることを目的として活動しています。<br>私たちKIT-Kyoto以外にOsaka, Kyoto, Tokyo_Metropolitan, UT-Tokyo, Tokyo Tech, Sapporoの7チームが参加し、様々な活動を行っています。これまで日本でのプレ大会や雑誌への記事投稿などを行ないました。<br />
: また、大学生から一般市民までを広く対象にアンケート調査を行いました。この調査は、合成生物学が持つ生命倫理や安全性の問題について日本人がどのような考えやイメージを持っているのか調査するためのものです。調査した層については、学生では生物専攻の学生だけでなく、化学や情報、機械、芸術専攻の人にも調査し、調査対象が偏らないようにしています。また、上記の高校生対象の説明会などでもアンケートにご協力いただきました。他にもiGEM Japanで作成したWeb上の解答フォームからも解答できるようにし、多様な層の意見を集められるようにしました。<br />
<br />
<br />
'''遺伝子組換え/バイオテクノロジーについてのアンケート'''<br />
{| style="margin: 1em auto 1em auto" width="965px"<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!1. 普段買い物をする時、表示があれば「遺伝子組換えでない」食品を買いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 必ず買う ・ どちらかといえば買うことが多い ・ あまり気にしない ・ 全く気にしない ・ そのような表示を見たことがない 〕 <br />
<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!2.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)と聞いて、何を連想しますか? ※あてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;"<br />
|<br />
: 〔 クローン ・ 組換え作物(食品) ・ 特許 ・ DNA ・ ゲノム ・ 医薬品 ・ 化粧品 ・ 生命倫理 ・ ウィルス ・ 人工生命 ・ ノーベル賞 ・ 環境 ・ 生物兵器 ・ iPS細胞、ES細胞 ・ バイオ燃料 ・ バイオハザード ・ その他( ) 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!3. 効果に違いがないとすれば、(遺伝子組み換え技術/バイオテクノロジー)を用いて製造された医薬品についてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 使用することに全く抵抗はない ・ 使用することにあまり抵抗はない ・ 可能なら使用は避けたい ・ 絶対に使用は避けたい ・ 分からない 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!4.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)を用いて、天然の生物の遺伝子を人工的に変えることについてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 やってはいけないと思う ・ どちらかといえばやってはいけないと思う・ どちらかといえばやってもいいと思う ・ やってもいいと思う 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!5.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)についての情報は、否定的か肯定的、どちらが多く感じますか? <br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 否定的なものが多い ・ 同じぐらいである ・ 肯定的なものが多い ・ わからない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!6.日本は、積極的に(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に取り組んでいると思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 そう思う ・ ややそう思う ・ あまり思わない ・ 思わない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!7.「(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に関する研究」は、<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 続けた方がいい ・ 止めた方がいい 〕と思う。<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <続けた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 食糧問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 環境問題の解決につながる可能性があるから<br />
# エネルギー問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 医療への応用が期待できるから<br />
# 新しいビジネスになるから<br />
# 種の保存に利用できるから<br />
# 科学技術の発展を象徴しているから<br />
# すでに多くの国が実用化しているから<br />
# 将来性があるから<br />
# 学問として面白いから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <止めた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 環境や人間に有害な生物が生み出される可能性があるから<br />
# 生態系への影響が懸念されるから<br />
# 人体への影響が懸念されるから<br />
# 倫理的に受け付けないから<br />
# 世間が危険だと言っているから<br />
# 悪用されるかもしれないから<br />
# 法整備が不十分だから<br />
# 現在ある技術でも代用できるから<br />
# 将来性が他の研究に比べてなさそうだから<br />
#なんとなく不安だから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!8. 「合成生物学(Synthetic Biology)」という言葉を今までに聞いたことがありますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 はい ・ いいえ 〕<br />
|}<br />
<br />
==== 結果 ====<br />
: iGEM JAPANのHuman Practiceアンケート結果より、全体の半数以上の人が遺伝子組み換えやバイオテクノロジーに関する研究を続けるべきと考えていることがわかりました。しかし、遺伝子組み換えでない食品を買う傾向や遺伝子組み換え・バイオテクノロジーによって作られた医薬品を避ける傾向がありました。また遺伝子組み換え技術に関しては'''半数以上が否定的'''なイメージを持っていることがわかりました。<BR><br />
<br />
==== 考察 ====<br />
:多くの人が遺伝子組み換えに関して漠然とした嫌悪感を抱いていると考えられます。研究を続けるべきと答えている人の多くが遺伝子組み換え技術を「食糧問題や医療技術へ応用」できると考えています。このことから遺伝子組み換えに関する知識があるとはいえます。しかし、メディアにより遺伝子組み換えに対して悪印象を持っていると思われます。これにより、遺伝子組み換え技術に対する理解と嫌悪という矛盾した意見の混合があると考えられます。これらは遺伝子組み換え技術の実態の不明瞭さが招いているものと考えられます。<BR><br />
<BR><br />
<br />
== '''未来の'''iGEM JAPAN'''チームへの貢献''' ==<br />
<br />
: 私たちはiGEMが推奨しているプロトコールを分かりやすく日本語化しました。また、日々の実験の記録を、実験のミス含め、目的から考察まで詳細に記述しました。今回私たちは、英語のLab noteだけでなく、より詳細なLab noteを日本語で作成しwikiで公開することにしました。この度あえて母国語のノートを作成したのは、私たちがLab noteにおいて大切とされる正確性をとても重要視しているためです。本来、実験ノートは、それを元にして実験を再現できる正確さ、詳細さを備えていなければなりません。これは、実験ノートに求められる非常に重要な要素です。しかし、これまでのiGEM参加チーム-特に非英語圏のチームのwikiでは、Lab noteの記入不足や表現の誤りなどが目立ち、この正確性を満たしているチームは非常に少ないのが実情です。私たちは今回のLab noteでこの正確性を満たすには、詳細をあえて母国語で書く事がベストであると判断し、このような形にしました。この形式は、今まで問題であったLab noteの正確性に対する一つの答えではないかと思います。また、こうして日本語で記入したノートを公開することにより、今後新たに参加する日本のチームの助けとなるでしょう。それがひいては日本におけるiGEMの知名度の向上につながると考えられます。<BR><br />
:[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/NotebookJ >>Lab Note へ]<br />
<br />
== '''他の'''iGEM team'''による調査への協力''' ==<br />
<br />
他のiGEMチームが行った調査に積極的に参加しました。これまでに参加した調査は下記のとおりです。<br />
:[[Team:Warsaw]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:METU_Turkey_Software]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Mexico-UNAM-CINVESTAV]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Edinburgh]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Freiburg_Bioware/NoteBook/Cuckoo_Clock]]: おもしろ写真コンテスト<br />
<html><body><div align="center"><br />
<embed type="application/x-shockwave-flash" src="http://picasaweb.google.com/s/c/bin/slideshow.swf" width="400" height="267" flashvars="host=picasaweb.google.com&hl=ja&feat=flashalbum&RGB=0x000000&feed=http%3A%2F%2Fpicasaweb.google.com%2Fdata%2Ffeed%2Fapi%2Fuser%2Fadbc963yk%2Falbumid%2F5532150873280077009%3Falt%3Drss%26kind%3Dphoto%26hl%3Dja" pluginspage="http://www.macromedia.com/go/getflashplayer"></embed></div><br />
</body></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJTeam:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ2010-10-27T00:24:19Z<p>Drosuke: /* 考察 */</p>
<hr />
<div>{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Human Practice]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPractice |English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
== '''はじめに''' ==<br />
<br />
: 現在、国際的に理科離れが進んでおり、どのようにScience Communicationを図るのかが問題となっています。日本でもその傾向が見られ、特に合成生物学の主幹技術である遺伝子組換え技術においては、「何か怖いものだ」という認識が根強くあります。遺伝子組換えとはどういったことなのか正しい理解もされていないまま、遺伝子組換え食品などは市場から実質的に排除されてしまっているのが現状です。今後、合成生物学が発達していくに伴って、国際的にこうした問題がより広がっていくと考えられます。<br />
: そこで私たちは、遺伝子組換えとはどういうことなのか、日本の、そして世界の多くの人に知ってもらうために、Human practiceにおいて次のような活動に取り組みました。<br />
<br />
== '''高校生向けの説明会''' ==<br />
==== 1.第一回オープンキャンパス (2010/08/10) ====<br />
: 高校生ならびにその保護者を対象にKIT-Kyotoのブースを設けました。<br />
: このブースではiGEMや、私たちの活動の紹介を行いました。高校生やその保護者の方が対象であるので、専門用語をできるだけ避け、できるだけ簡単な言葉で分かりやすい説明となるように心がけました。また、遺伝子組換え実験のモデル生物である酵母、カイコ、ショウジョウバエ、大腸菌の生体を展示しました。カイコに直接触れることのできるコーナーやショウジョウバエの遺伝子組換え系統の展示も行い、「何か得体の知れない物」という認識が強い遺伝子組換え技術に関して正しく理解でき、さらに親しみを覚えることができる展示となるようにしました。当日は約200人の高校生が訪れ、具体的なモデル生物を目の当たりにしてより生物学についてのイメージが膨らんできた等の意見を頂きました。<br />
<br />
:[[Image:KITOC1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2.jpg|150px]] [[Image:KITOC3.jpg|150px]] [[Image:KITOC4.jpg|150px]] [[Image:KITOC5.jpg|150px]]<br />
:Poster<br />
:[[Image:KITOC1.png|150px]] [[Image:KITOC2.png|150px]] [[Image:KITOC3.png|150px]]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
==== 2.第二回オープンキャンパス(2010/10/17) ====<br />
<br />
: 高校生やその保護者を対象にブースを設けました。今回は、前回の展示に加えて、コピックを用いた「E.coli pen」の試作版を実際に高校生に体験してもらい、化学と芸術の融合を楽しんでもらうことが出来ました。その他、大学見学に来た高校生への紹介活動も行っています。<br />
<br />
:[[Image:KITOC2-0.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-3.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-2.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-5.jpg|150px]]<br />
:[[Image:KITOC2-6.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-4.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-7.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-8.jpg|150px]] [[Image:KITOCPOSTER4.jpg|150px]]<br />
<br />
== KIT VL'''研究プロジェクト''' ==<br />
<br />
: KITベンチャーラボラトリーの「VL研究プロジェクト」に「E.coli pen」を出展しました。審査員である本学の様々な分野の先生方に、iGEMの目的や私たちのプロジェクトが目指すもの、E.coli penの設計図、完成予想図などを提出し、好意的な評価をいただくことができました。<BR><br />
:[http://www.vl.kit.jp/ja/project/2010.html >>the University Venture Business desk at KIT]<br />
<br />
== iGEM Japan'''への参加、ならびにアンケート調査への参加''' ==<br />
<br />
: 私たちKIT-Kyotoは日本でのiGEMの知名度を高めるためにiGEM Japanに参加しています。iGEM Japanは日本のiGEM参加有志チームによる組織であり、各チームの連携を深めることによりiGEMをより活性化させるとともに、日本におけるiGEMの知名度を高めることを目的として活動しています。<br>私たちKIT-Kyoto以外にOsaka, Kyoto, Tokyo_Metropolitan, UT-Tokyo, Tokyo Tech, Sapporoの7チームが参加し、様々な活動を行っています。これまで日本でのプレ大会や雑誌への記事投稿などを行ないました。<br />
: また、大学生から一般市民までを広く対象にアンケート調査を行いました。この調査は、合成生物学が持つ生命倫理や安全性の問題について日本人がどのような考えやイメージを持っているのか調査するためのものです。調査した層については、学生では生物専攻の学生だけでなく、化学や情報、機械、芸術専攻の人にも調査し、調査対象が偏らないようにしています。また、上記の高校生対象の説明会などでもアンケートにご協力いただきました。他にもiGEM Japanで作成したWeb上の解答フォームからも解答できるようにし、多様な層の意見を集められるようにしました。<br />
<br />
<br />
'''遺伝子組換え/バイオテクノロジーについてのアンケート'''<br />
{| style="margin: 1em auto 1em auto" width="965px"<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!1. 普段買い物をする時、表示があれば「遺伝子組換えでない」食品を買いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 必ず買う ・ どちらかといえば買うことが多い ・ あまり気にしない ・ 全く気にしない ・ そのような表示を見たことがない 〕 <br />
<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!2.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)と聞いて、何を連想しますか? ※あてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;"<br />
|<br />
: 〔 クローン ・ 組換え作物(食品) ・ 特許 ・ DNA ・ ゲノム ・ 医薬品 ・ 化粧品 ・ 生命倫理 ・ ウィルス ・ 人工生命 ・ ノーベル賞 ・ 環境 ・ 生物兵器 ・ iPS細胞、ES細胞 ・ バイオ燃料 ・ バイオハザード ・ その他( ) 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!3. 効果に違いがないとすれば、(遺伝子組み換え技術/バイオテクノロジー)を用いて製造された医薬品についてどう思いますか?<br />
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|<br />
: 〔 使用することに全く抵抗はない ・ 使用することにあまり抵抗はない ・ 可能なら使用は避けたい ・ 絶対に使用は避けたい ・ 分からない 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!4.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)を用いて、天然の生物の遺伝子を人工的に変えることについてどう思いますか?<br />
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|<br />
:〔 やってはいけないと思う ・ どちらかといえばやってはいけないと思う・ どちらかといえばやってもいいと思う ・ やってもいいと思う 〕<br />
<br />
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!5.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)についての情報は、否定的か肯定的、どちらが多く感じますか? <br />
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|<br />
:〔 否定的なものが多い ・ 同じぐらいである ・ 肯定的なものが多い ・ わからない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!6.日本は、積極的に(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に取り組んでいると思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 そう思う ・ ややそう思う ・ あまり思わない ・ 思わない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!7.「(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に関する研究」は、<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 続けた方がいい ・ 止めた方がいい 〕と思う。<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <続けた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 食糧問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 環境問題の解決につながる可能性があるから<br />
# エネルギー問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 医療への応用が期待できるから<br />
# 新しいビジネスになるから<br />
# 種の保存に利用できるから<br />
# 科学技術の発展を象徴しているから<br />
# すでに多くの国が実用化しているから<br />
# 将来性があるから<br />
# 学問として面白いから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <止めた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 環境や人間に有害な生物が生み出される可能性があるから<br />
# 生態系への影響が懸念されるから<br />
# 人体への影響が懸念されるから<br />
# 倫理的に受け付けないから<br />
# 世間が危険だと言っているから<br />
# 悪用されるかもしれないから<br />
# 法整備が不十分だから<br />
# 現在ある技術でも代用できるから<br />
# 将来性が他の研究に比べてなさそうだから<br />
#なんとなく不安だから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!8. 「合成生物学(Synthetic Biology)」という言葉を今までに聞いたことがありますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 はい ・ いいえ 〕<br />
|}<br />
<br />
==== 結果 ====<br />
:iGEM JAPANのHuman Practiceアンケート結果より、全体の半数以上の人が遺伝子組み換えやバイオテクノロジーに関する研究を続けるべきと考えていることがわかりました。しかし、遺伝子組み換えでない食品を買う傾向や遺伝子組み換え・バイオテクノロジーによって作られた医薬品を避ける傾向がありました。また遺伝子組み換え技術に関しては'''半数以上が否定的'''なイメージを持っていることがわかりました。<BR><br />
<br />
==== 考察 ====<br />
:多くの人が遺伝子組み換えに関して漠然とした嫌悪感を抱いていると考えられます。研究を続けるべきと答えている人の多くが遺伝子組み換え技術を「食糧問題や医療技術へ応用」できると考えています。このことから遺伝子組み換えに関する知識があるとはいえます。しかし、メディアにより遺伝子組み換えに対して悪印象を持っていると思われます。これにより、遺伝子組み換え技術に対する理解と嫌悪という矛盾した意見の混合があると考えられます。これらは遺伝子組み換え技術の実態の不明瞭さが招いているものと考えられます。<BR><br />
<BR><br />
<br />
== '''未来の'''iGEM JAPAN'''チームへの貢献''' ==<br />
<br />
: 私たちはiGEMが推奨しているプロトコールを分かりやすく日本語化しました。また、日々の実験の記録を、実験のミス含め、目的から考察まで詳細に記述しました。今回私たちは、英語のLab noteだけでなく、より詳細なLab noteを日本語で作成しwikiで公開することにしました。この度あえて母国語のノートを作成したのは、私たちがLab noteにおいて大切とされる正確性をとても重要視しているためです。本来、実験ノートは、それを元にして実験を再現できる正確さ、詳細さを備えていなければなりません。これは、実験ノートに求められる非常に重要な要素です。しかし、これまでのiGEM参加チーム-特に非英語圏のチームのwikiでは、Lab noteの記入不足や表現の誤りなどが目立ち、この正確性を満たしているチームは非常に少ないのが実情です。私たちは今回のLab noteでこの正確性を満たすには、詳細をあえて母国語で書く事がベストであると判断し、このような形にしました。この形式は、今まで問題であったLab noteの正確性に対する一つの答えではないかと思います。また、こうして日本語で記入したノートを公開することにより、今後新たに参加する日本のチームの助けとなるでしょう。それがひいては日本におけるiGEMの知名度の向上につながると考えられます。<BR><br />
:[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/NotebookJ >>Lab Note へ]<br />
<br />
== '''他の'''iGEM team'''による調査への協力''' ==<br />
<br />
他のiGEMチームが行った調査に積極的に参加しました。これまでに参加した調査は下記のとおりです。<br />
:[[Team:Warsaw]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:METU_Turkey_Software]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Mexico-UNAM-CINVESTAV]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Edinburgh]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Freiburg_Bioware/NoteBook/Cuckoo_Clock]]: おもしろ写真コンテスト<br />
<html><body><div align="center"><br />
<embed type="application/x-shockwave-flash" src="http://picasaweb.google.com/s/c/bin/slideshow.swf" width="400" height="267" flashvars="host=picasaweb.google.com&hl=ja&feat=flashalbum&RGB=0x000000&feed=http%3A%2F%2Fpicasaweb.google.com%2Fdata%2Ffeed%2Fapi%2Fuser%2Fadbc963yk%2Falbumid%2F5532150873280077009%3Falt%3Drss%26kind%3Dphoto%26hl%3Dja" pluginspage="http://www.macromedia.com/go/getflashplayer"></embed></div><br />
</body></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJTeam:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ2010-10-27T00:23:48Z<p>Drosuke: /* 結果 */</p>
<hr />
<div>{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Human Practice]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPractice |English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
== '''はじめに''' ==<br />
<br />
: 現在、国際的に理科離れが進んでおり、どのようにScience Communicationを図るのかが問題となっています。日本でもその傾向が見られ、特に合成生物学の主幹技術である遺伝子組換え技術においては、「何か怖いものだ」という認識が根強くあります。遺伝子組換えとはどういったことなのか正しい理解もされていないまま、遺伝子組換え食品などは市場から実質的に排除されてしまっているのが現状です。今後、合成生物学が発達していくに伴って、国際的にこうした問題がより広がっていくと考えられます。<br />
: そこで私たちは、遺伝子組換えとはどういうことなのか、日本の、そして世界の多くの人に知ってもらうために、Human practiceにおいて次のような活動に取り組みました。<br />
<br />
== '''高校生向けの説明会''' ==<br />
==== 1.第一回オープンキャンパス (2010/08/10) ====<br />
: 高校生ならびにその保護者を対象にKIT-Kyotoのブースを設けました。<br />
: このブースではiGEMや、私たちの活動の紹介を行いました。高校生やその保護者の方が対象であるので、専門用語をできるだけ避け、できるだけ簡単な言葉で分かりやすい説明となるように心がけました。また、遺伝子組換え実験のモデル生物である酵母、カイコ、ショウジョウバエ、大腸菌の生体を展示しました。カイコに直接触れることのできるコーナーやショウジョウバエの遺伝子組換え系統の展示も行い、「何か得体の知れない物」という認識が強い遺伝子組換え技術に関して正しく理解でき、さらに親しみを覚えることができる展示となるようにしました。当日は約200人の高校生が訪れ、具体的なモデル生物を目の当たりにしてより生物学についてのイメージが膨らんできた等の意見を頂きました。<br />
<br />
:[[Image:KITOC1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2.jpg|150px]] [[Image:KITOC3.jpg|150px]] [[Image:KITOC4.jpg|150px]] [[Image:KITOC5.jpg|150px]]<br />
:Poster<br />
:[[Image:KITOC1.png|150px]] [[Image:KITOC2.png|150px]] [[Image:KITOC3.png|150px]]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
==== 2.第二回オープンキャンパス(2010/10/17) ====<br />
<br />
: 高校生やその保護者を対象にブースを設けました。今回は、前回の展示に加えて、コピックを用いた「E.coli pen」の試作版を実際に高校生に体験してもらい、化学と芸術の融合を楽しんでもらうことが出来ました。その他、大学見学に来た高校生への紹介活動も行っています。<br />
<br />
:[[Image:KITOC2-0.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-3.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-2.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-5.jpg|150px]]<br />
:[[Image:KITOC2-6.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-4.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-7.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-8.jpg|150px]] [[Image:KITOCPOSTER4.jpg|150px]]<br />
<br />
== KIT VL'''研究プロジェクト''' ==<br />
<br />
: KITベンチャーラボラトリーの「VL研究プロジェクト」に「E.coli pen」を出展しました。審査員である本学の様々な分野の先生方に、iGEMの目的や私たちのプロジェクトが目指すもの、E.coli penの設計図、完成予想図などを提出し、好意的な評価をいただくことができました。<BR><br />
:[http://www.vl.kit.jp/ja/project/2010.html >>the University Venture Business desk at KIT]<br />
<br />
== iGEM Japan'''への参加、ならびにアンケート調査への参加''' ==<br />
<br />
: 私たちKIT-Kyotoは日本でのiGEMの知名度を高めるためにiGEM Japanに参加しています。iGEM Japanは日本のiGEM参加有志チームによる組織であり、各チームの連携を深めることによりiGEMをより活性化させるとともに、日本におけるiGEMの知名度を高めることを目的として活動しています。<br>私たちKIT-Kyoto以外にOsaka, Kyoto, Tokyo_Metropolitan, UT-Tokyo, Tokyo Tech, Sapporoの7チームが参加し、様々な活動を行っています。これまで日本でのプレ大会や雑誌への記事投稿などを行ないました。<br />
: また、大学生から一般市民までを広く対象にアンケート調査を行いました。この調査は、合成生物学が持つ生命倫理や安全性の問題について日本人がどのような考えやイメージを持っているのか調査するためのものです。調査した層については、学生では生物専攻の学生だけでなく、化学や情報、機械、芸術専攻の人にも調査し、調査対象が偏らないようにしています。また、上記の高校生対象の説明会などでもアンケートにご協力いただきました。他にもiGEM Japanで作成したWeb上の解答フォームからも解答できるようにし、多様な層の意見を集められるようにしました。<br />
<br />
<br />
'''遺伝子組換え/バイオテクノロジーについてのアンケート'''<br />
{| style="margin: 1em auto 1em auto" width="965px"<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!1. 普段買い物をする時、表示があれば「遺伝子組換えでない」食品を買いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 必ず買う ・ どちらかといえば買うことが多い ・ あまり気にしない ・ 全く気にしない ・ そのような表示を見たことがない 〕 <br />
<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!2.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)と聞いて、何を連想しますか? ※あてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;"<br />
|<br />
: 〔 クローン ・ 組換え作物(食品) ・ 特許 ・ DNA ・ ゲノム ・ 医薬品 ・ 化粧品 ・ 生命倫理 ・ ウィルス ・ 人工生命 ・ ノーベル賞 ・ 環境 ・ 生物兵器 ・ iPS細胞、ES細胞 ・ バイオ燃料 ・ バイオハザード ・ その他( ) 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!3. 効果に違いがないとすれば、(遺伝子組み換え技術/バイオテクノロジー)を用いて製造された医薬品についてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 使用することに全く抵抗はない ・ 使用することにあまり抵抗はない ・ 可能なら使用は避けたい ・ 絶対に使用は避けたい ・ 分からない 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!4.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)を用いて、天然の生物の遺伝子を人工的に変えることについてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 やってはいけないと思う ・ どちらかといえばやってはいけないと思う・ どちらかといえばやってもいいと思う ・ やってもいいと思う 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!5.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)についての情報は、否定的か肯定的、どちらが多く感じますか? <br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 否定的なものが多い ・ 同じぐらいである ・ 肯定的なものが多い ・ わからない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!6.日本は、積極的に(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に取り組んでいると思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 そう思う ・ ややそう思う ・ あまり思わない ・ 思わない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!7.「(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に関する研究」は、<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 続けた方がいい ・ 止めた方がいい 〕と思う。<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <続けた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 食糧問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 環境問題の解決につながる可能性があるから<br />
# エネルギー問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 医療への応用が期待できるから<br />
# 新しいビジネスになるから<br />
# 種の保存に利用できるから<br />
# 科学技術の発展を象徴しているから<br />
# すでに多くの国が実用化しているから<br />
# 将来性があるから<br />
# 学問として面白いから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <止めた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
# 環境や人間に有害な生物が生み出される可能性があるから<br />
# 生態系への影響が懸念されるから<br />
# 人体への影響が懸念されるから<br />
# 倫理的に受け付けないから<br />
# 世間が危険だと言っているから<br />
# 悪用されるかもしれないから<br />
# 法整備が不十分だから<br />
# 現在ある技術でも代用できるから<br />
# 将来性が他の研究に比べてなさそうだから<br />
#なんとなく不安だから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!8. 「合成生物学(Synthetic Biology)」という言葉を今までに聞いたことがありますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 はい ・ いいえ 〕<br />
|}<br />
<br />
==== 結果 ====<br />
:iGEM JAPANのHuman Practiceアンケート結果より、全体の半数以上の人が遺伝子組み換えやバイオテクノロジーに関する研究を続けるべきと考えていることがわかりました。しかし、遺伝子組み換えでない食品を買う傾向や遺伝子組み換え・バイオテクノロジーによって作られた医薬品を避ける傾向がありました。また遺伝子組み換え技術に関しては'''半数以上が否定的'''なイメージを持っていることがわかりました。<BR><br />
<br />
==== 考察 ====<br />
多くの人が遺伝子組み換えに関して漠然とした嫌悪感を抱いていると考えられます。研究を続けるべきと答えている人の多くが遺伝子組み換え技術を「食糧問題や医療技術へ応用」できると考えています。このことから遺伝子組み換えに関する知識があるとはいえます。しかし、メディアにより遺伝子組み換えに対して悪印象を持っていると思われます。これにより、遺伝子組み換え技術に対する理解と嫌悪という矛盾した意見の混合があると考えられます。これらは遺伝子組み換え技術の実態の不明瞭さが招いているものと考えられます。<BR><br />
<BR><br />
<br />
== '''未来の'''iGEM JAPAN'''チームへの貢献''' ==<br />
<br />
: 私たちはiGEMが推奨しているプロトコールを分かりやすく日本語化しました。また、日々の実験の記録を、実験のミス含め、目的から考察まで詳細に記述しました。今回私たちは、英語のLab noteだけでなく、より詳細なLab noteを日本語で作成しwikiで公開することにしました。この度あえて母国語のノートを作成したのは、私たちがLab noteにおいて大切とされる正確性をとても重要視しているためです。本来、実験ノートは、それを元にして実験を再現できる正確さ、詳細さを備えていなければなりません。これは、実験ノートに求められる非常に重要な要素です。しかし、これまでのiGEM参加チーム-特に非英語圏のチームのwikiでは、Lab noteの記入不足や表現の誤りなどが目立ち、この正確性を満たしているチームは非常に少ないのが実情です。私たちは今回のLab noteでこの正確性を満たすには、詳細をあえて母国語で書く事がベストであると判断し、このような形にしました。この形式は、今まで問題であったLab noteの正確性に対する一つの答えではないかと思います。また、こうして日本語で記入したノートを公開することにより、今後新たに参加する日本のチームの助けとなるでしょう。それがひいては日本におけるiGEMの知名度の向上につながると考えられます。<BR><br />
:[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/NotebookJ >>Lab Note へ]<br />
<br />
== '''他の'''iGEM team'''による調査への協力''' ==<br />
<br />
他のiGEMチームが行った調査に積極的に参加しました。これまでに参加した調査は下記のとおりです。<br />
:[[Team:Warsaw]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:METU_Turkey_Software]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Mexico-UNAM-CINVESTAV]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Edinburgh]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Freiburg_Bioware/NoteBook/Cuckoo_Clock]]: おもしろ写真コンテスト<br />
<html><body><div align="center"><br />
<embed type="application/x-shockwave-flash" src="http://picasaweb.google.com/s/c/bin/slideshow.swf" width="400" height="267" flashvars="host=picasaweb.google.com&hl=ja&feat=flashalbum&RGB=0x000000&feed=http%3A%2F%2Fpicasaweb.google.com%2Fdata%2Ffeed%2Fapi%2Fuser%2Fadbc963yk%2Falbumid%2F5532150873280077009%3Falt%3Drss%26kind%3Dphoto%26hl%3Dja" pluginspage="http://www.macromedia.com/go/getflashplayer"></embed></div><br />
</body></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosukehttp://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJTeam:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ2010-10-27T00:22:18Z<p>Drosuke: /* 考察 */</p>
<hr />
<div>{{Template:KIT-Kyoto/menuJ}}<br />
<table border=0 width="965px" align="center"><tr><td><br />
<div aling="left">[[Team:KIT-Kyoto/HomeJ|Home]] > [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Human Practice]]</div></td><td><div align="right">Language : [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPractice |English]] / [[Team:KIT-Kyoto/Project/HumanPracticeJ|Japanese]]</div></td></tr></table><br />
<div id="NAKAMI"><br />
== '''はじめに''' ==<br />
<br />
: 現在、国際的に理科離れが進んでおり、どのようにScience Communicationを図るのかが問題となっています。日本でもその傾向が見られ、特に合成生物学の主幹技術である遺伝子組換え技術においては、「何か怖いものだ」という認識が根強くあります。遺伝子組換えとはどういったことなのか正しい理解もされていないまま、遺伝子組換え食品などは市場から実質的に排除されてしまっているのが現状です。今後、合成生物学が発達していくに伴って、国際的にこうした問題がより広がっていくと考えられます。<br />
: そこで私たちは、遺伝子組換えとはどういうことなのか、日本の、そして世界の多くの人に知ってもらうために、Human practiceにおいて次のような活動に取り組みました。<br />
<br />
== '''高校生向けの説明会''' ==<br />
==== 1.第一回オープンキャンパス (2010/08/10) ====<br />
: 高校生ならびにその保護者を対象にKIT-Kyotoのブースを設けました。<br />
: このブースではiGEMや、私たちの活動の紹介を行いました。高校生やその保護者の方が対象であるので、専門用語をできるだけ避け、できるだけ簡単な言葉で分かりやすい説明となるように心がけました。また、遺伝子組換え実験のモデル生物である酵母、カイコ、ショウジョウバエ、大腸菌の生体を展示しました。カイコに直接触れることのできるコーナーやショウジョウバエの遺伝子組換え系統の展示も行い、「何か得体の知れない物」という認識が強い遺伝子組換え技術に関して正しく理解でき、さらに親しみを覚えることができる展示となるようにしました。当日は約200人の高校生が訪れ、具体的なモデル生物を目の当たりにしてより生物学についてのイメージが膨らんできた等の意見を頂きました。<br />
<br />
:[[Image:KITOC1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2.jpg|150px]] [[Image:KITOC3.jpg|150px]] [[Image:KITOC4.jpg|150px]] [[Image:KITOC5.jpg|150px]]<br />
:Poster<br />
:[[Image:KITOC1.png|150px]] [[Image:KITOC2.png|150px]] [[Image:KITOC3.png|150px]]<br />
<br />
<BR><br />
<br />
==== 2.第二回オープンキャンパス(2010/10/17) ====<br />
<br />
: 高校生やその保護者を対象にブースを設けました。今回は、前回の展示に加えて、コピックを用いた「E.coli pen」の試作版を実際に高校生に体験してもらい、化学と芸術の融合を楽しんでもらうことが出来ました。その他、大学見学に来た高校生への紹介活動も行っています。<br />
<br />
:[[Image:KITOC2-0.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-3.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-2.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-1.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-5.jpg|150px]]<br />
:[[Image:KITOC2-6.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-4.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-7.jpg|150px]] [[Image:KITOC2-8.jpg|150px]] [[Image:KITOCPOSTER4.jpg|150px]]<br />
<br />
== KIT VL'''研究プロジェクト''' ==<br />
<br />
: KITベンチャーラボラトリーの「VL研究プロジェクト」に「E.coli pen」を出展しました。審査員である本学の様々な分野の先生方に、iGEMの目的や私たちのプロジェクトが目指すもの、E.coli penの設計図、完成予想図などを提出し、好意的な評価をいただくことができました。<BR><br />
:[http://www.vl.kit.jp/ja/project/2010.html >>the University Venture Business desk at KIT]<br />
<br />
== iGEM Japan'''への参加、ならびにアンケート調査への参加''' ==<br />
<br />
: 私たちKIT-Kyotoは日本でのiGEMの知名度を高めるためにiGEM Japanに参加しています。iGEM Japanは日本のiGEM参加有志チームによる組織であり、各チームの連携を深めることによりiGEMをより活性化させるとともに、日本におけるiGEMの知名度を高めることを目的として活動しています。<br>私たちKIT-Kyoto以外にOsaka, Kyoto, Tokyo_Metropolitan, UT-Tokyo, Tokyo Tech, Sapporoの7チームが参加し、様々な活動を行っています。これまで日本でのプレ大会や雑誌への記事投稿などを行ないました。<br />
: また、大学生から一般市民までを広く対象にアンケート調査を行いました。この調査は、合成生物学が持つ生命倫理や安全性の問題について日本人がどのような考えやイメージを持っているのか調査するためのものです。調査した層については、学生では生物専攻の学生だけでなく、化学や情報、機械、芸術専攻の人にも調査し、調査対象が偏らないようにしています。また、上記の高校生対象の説明会などでもアンケートにご協力いただきました。他にもiGEM Japanで作成したWeb上の解答フォームからも解答できるようにし、多様な層の意見を集められるようにしました。<br />
<br />
<br />
'''遺伝子組換え/バイオテクノロジーについてのアンケート'''<br />
{| style="margin: 1em auto 1em auto" width="965px"<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!1. 普段買い物をする時、表示があれば「遺伝子組換えでない」食品を買いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 必ず買う ・ どちらかといえば買うことが多い ・ あまり気にしない ・ 全く気にしない ・ そのような表示を見たことがない 〕 <br />
<br />
|- style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!2.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)と聞いて、何を連想しますか? ※あてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;"<br />
|<br />
: 〔 クローン ・ 組換え作物(食品) ・ 特許 ・ DNA ・ ゲノム ・ 医薬品 ・ 化粧品 ・ 生命倫理 ・ ウィルス ・ 人工生命 ・ ノーベル賞 ・ 環境 ・ 生物兵器 ・ iPS細胞、ES細胞 ・ バイオ燃料 ・ バイオハザード ・ その他( ) 〕<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!3. 効果に違いがないとすれば、(遺伝子組み換え技術/バイオテクノロジー)を用いて製造された医薬品についてどう思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 使用することに全く抵抗はない ・ 使用することにあまり抵抗はない ・ 可能なら使用は避けたい ・ 絶対に使用は避けたい ・ 分からない 〕<br />
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!4.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)を用いて、天然の生物の遺伝子を人工的に変えることについてどう思いますか?<br />
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|<br />
:〔 やってはいけないと思う ・ どちらかといえばやってはいけないと思う・ どちらかといえばやってもいいと思う ・ やってもいいと思う 〕<br />
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!5.(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)についての情報は、否定的か肯定的、どちらが多く感じますか? <br />
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|<br />
:〔 否定的なものが多い ・ 同じぐらいである ・ 肯定的なものが多い ・ わからない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!6.日本は、積極的に(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に取り組んでいると思いますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 そう思う ・ ややそう思う ・ あまり思わない ・ 思わない 〕 <br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!7.「(遺伝子組換え技術/バイオテクノロジー)に関する研究」は、<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
: 〔 続けた方がいい ・ 止めた方がいい 〕と思う。<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <続けた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
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|<br />
# 食糧問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 環境問題の解決につながる可能性があるから<br />
# エネルギー問題の解決につながる可能性があるから<br />
# 医療への応用が期待できるから<br />
# 新しいビジネスになるから<br />
# 種の保存に利用できるから<br />
# 科学技術の発展を象徴しているから<br />
# すでに多くの国が実用化しているから<br />
# 将来性があるから<br />
# 学問として面白いから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!<br />
: <止めた方がいい>に丸をつけた方へ:下から理由としてあてはまるものすべてに丸をつけてください。<br />
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|<br />
# 環境や人間に有害な生物が生み出される可能性があるから<br />
# 生態系への影響が懸念されるから<br />
# 人体への影響が懸念されるから<br />
# 倫理的に受け付けないから<br />
# 世間が危険だと言っているから<br />
# 悪用されるかもしれないから<br />
# 法整備が不十分だから<br />
# 現在ある技術でも代用できるから<br />
# 将来性が他の研究に比べてなさそうだから<br />
#なんとなく不安だから<br />
# その他( )<br />
<br />
|-style="background-color:#c1e4e9;" <br />
!8. 「合成生物学(Synthetic Biology)」という言葉を今までに聞いたことがありますか?<br />
|- style="background-color:#eaf4fc;" <br />
|<br />
:〔 はい ・ いいえ 〕<br />
|}<br />
<br />
==== 結果 ====<br />
iGEM JAPANのHuman Practiceアンケート結果より、全体の半数以上の人が遺伝子組み換えやバイオテクノロジーに関する研究を続けるべきと考えていることがわかりました。しかし、遺伝子組み換えでない食品を買う傾向や遺伝子組み換え・バイオテクノロジーによって作られた医薬品を避ける傾向がありました。また遺伝子組み換え技術に関しては'''半数以上が否定的'''なイメージを持っていることがわかりました。<BR><br />
<br />
==== 考察 ====<br />
多くの人が遺伝子組み換えに関して漠然とした嫌悪感を抱いていると考えられます。研究を続けるべきと答えている人の多くが遺伝子組み換え技術を「食糧問題や医療技術へ応用」できると考えています。このことから遺伝子組み換えに関する知識があるとはいえます。しかし、メディアにより遺伝子組み換えに対して悪印象を持っていると思われます。これにより、遺伝子組み換え技術に対する理解と嫌悪という矛盾した意見の混合があると考えられます。これらは遺伝子組み換え技術の実態の不明瞭さが招いているものと考えられます。<BR><br />
<BR><br />
<br />
== '''未来の'''iGEM JAPAN'''チームへの貢献''' ==<br />
<br />
: 私たちはiGEMが推奨しているプロトコールを分かりやすく日本語化しました。また、日々の実験の記録を、実験のミス含め、目的から考察まで詳細に記述しました。今回私たちは、英語のLab noteだけでなく、より詳細なLab noteを日本語で作成しwikiで公開することにしました。この度あえて母国語のノートを作成したのは、私たちがLab noteにおいて大切とされる正確性をとても重要視しているためです。本来、実験ノートは、それを元にして実験を再現できる正確さ、詳細さを備えていなければなりません。これは、実験ノートに求められる非常に重要な要素です。しかし、これまでのiGEM参加チーム-特に非英語圏のチームのwikiでは、Lab noteの記入不足や表現の誤りなどが目立ち、この正確性を満たしているチームは非常に少ないのが実情です。私たちは今回のLab noteでこの正確性を満たすには、詳細をあえて母国語で書く事がベストであると判断し、このような形にしました。この形式は、今まで問題であったLab noteの正確性に対する一つの答えではないかと思います。また、こうして日本語で記入したノートを公開することにより、今後新たに参加する日本のチームの助けとなるでしょう。それがひいては日本におけるiGEMの知名度の向上につながると考えられます。<BR><br />
:[https://2010.igem.org/Team:KIT-Kyoto/NotebookJ >>Lab Note へ]<br />
<br />
== '''他の'''iGEM team'''による調査への協力''' ==<br />
<br />
他のiGEMチームが行った調査に積極的に参加しました。これまでに参加した調査は下記のとおりです。<br />
:[[Team:Warsaw]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:METU_Turkey_Software]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Mexico-UNAM-CINVESTAV]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Edinburgh]]: 合成生物学に関するアンケートに協力<br />
:[[Team:Freiburg_Bioware/NoteBook/Cuckoo_Clock]]: おもしろ写真コンテスト<br />
<html><body><div align="center"><br />
<embed type="application/x-shockwave-flash" src="http://picasaweb.google.com/s/c/bin/slideshow.swf" width="400" height="267" flashvars="host=picasaweb.google.com&hl=ja&feat=flashalbum&RGB=0x000000&feed=http%3A%2F%2Fpicasaweb.google.com%2Fdata%2Ffeed%2Fapi%2Fuser%2Fadbc963yk%2Falbumid%2F5532150873280077009%3Falt%3Drss%26kind%3Dphoto%26hl%3Dja" pluginspage="http://www.macromedia.com/go/getflashplayer"></embed></div><br />
</body></html><br />
{{Template:KIT-Kyoto-1}}</div>Drosuke