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From 2010.igem.org

September 3

Time

9:00～

Member

福山,足立,吉村

Fukuyama,Adachi,Yoshimura

Purpose

(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理　[吉村]

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理　[足立]

(3)　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),

pSB1A2(I13507),pSB6A1(BBa K121013)の電気泳動　[福山]

Method

(1)　pSB6A1(K121013)のプラスミド抽出・制限酵素処理

前日から培養していた大腸菌を1.5mlエッペンにうつした 　↓15,000rpm,25℃で1分間遠心した（集菌） 　↓上清を捨てた 　↓SolutionⅠを250μl加え、ピペッティング、ボルテックスして沈殿を完全に溶かした 　↓SolutionⅡを250μl加え、4~5回上下にして混ぜた(膜溶解) 　↓1分間放置した 　↓SolutionⅢを350μl加えた(タンパク質析出) 　↓13,000rpm,25℃で5分間遠心した 　↓上清をカラムに流した 　↓13,000rpm,25℃で30秒間カラムごと遠心した 　↓溶出液を捨てた 　↓SolutionⅣを500μl加えた 　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した 　↓溶出液を捨てた 　↓SolutionⅤを700μl加えた 　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心した 　↓溶出液を捨て、もう一度13,000rpm,25℃で30秒間遠心した 　↓溶出液を捨て、チューブを蓋を切り取ったエッペンに取りかえた 　↓滅菌水を100μl加えた(DNA溶出) 　↓13,000rpm,25℃で30秒間遠心し、プラスミドを濃縮した 　↓制限酵素処理を行うために吸光度を測った 　　(値を右表1に示した) 　↓右表に示した組成で制限酵素処理を行った 　↓37℃で40分間インキュベートした 　↓135Vで15分間電気泳動してカットチェックをおこなった			表1: 吸光度 ×1/100 pSB6A1 1回目 0.041 2回目 0.047 3回目 0.047 4回目 0.050 5回目 0.045 Ave. 0.046
			表2: 試薬組成 DNA 10μl EcoRⅠ 0.3μl PstⅠ 0.3μl M Buffer 6μl Milli Q 7.4μl Total 20μl

(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理

pSB6A1(BBa K121013)の制限酵素処理をするために吸光計によりOD260で濁度を測定した 　濁度の測定結果を右表3に示す 　　　表3: pSB6A1(BBa K121013)の100倍希釈したときの濁度 　表3より、DNA濃度：0.0108×100×50＝0.54×102(μg/ml)と分かった 　これは制限酵素処理するのに濃度が低すぎるため、翌日濃縮することにした

表3: 濁度 ×1/100 pSB6A1 1回目 0.007 2回目 0.015 3回目 0.008 4回目 0.012 5回目 0.012 Ave. 0.0108

(3)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(BBa K121013)の電気泳動

　ゲル抽出を終えたpSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430),pSB1A2(I13507),pSB6A1(K121013)を

　それぞれ5μlとって1μlのloading dyeを加えた

　↓1％アがロースゲルを用いて、1kbp ladderとともに100Vで3時間電気泳動した

Results

(1)　バンドが出なかった

(2)　pSB6A1(BBa K121013)のDNA濃度が薄すぎたため、制限酵素処理ができなかった

(3)　pSB1A2(E0420)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　

pSB1A2(E0430)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　

pSB1A2(I13507)→マーカーの濃さと比較して、およそ6ng/μlと判断した　

pSB6A1(K121013)→バンドは確認できなかった

Consideration

(1)　試薬に問題ありか？

(3)　pSB6A1(K121013)→非常に薄いDNA溶液であると思われる