Template:KIT-Kyoto-Augsut19

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Augsut 19

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【時間】　9:00～

【実験担当】岩城、古道、竹内、中村

【実験名】
(1)l13522[2-（8A）]とR0040（1-6I）のトランスフォーメーション
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のストリーク
(3)pSB1C1（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ（18日の続き）
(4)PoxyR、acrABのPCRと電気泳動

【実験目的】
(1)l13522[2-（8A）]とR0040（1-6I）のトランスフォーメーション
(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602のシングルコロニーを得る
(3) pSB1C3（提出用ベクター）、pSB1A2（GFP on pSB1）のミディプレ
(4)プロモーター（PoxyR、acrAB）を増やし、それを確認する
【実験内容】
(1)-80℃で保存していたコンピタントセル（DH5α）を氷上で溶解
　　　　　　　　　　↓
　　DH5α100μLに対し、l13522[2-（8A）]及び、R0040（1-6I）各1μLずつを、1.5mLエッペンに混合
　　　　　　　　　　↓
　　on　ice　30min
　　　　　　　　　　↓
　　45℃で45sec、ヒートショック
　　　　　　　　　　↓
　　on　ice　2min
　　　　　　　　　　↓
　　各チューブにSOC培地を、0.9mLずつ加えた
　　　　　　　　　　↓
　　37℃で1h、振とう培養
　　　　　　　　　　↓
　　培養後、全量をLBプレート（+amp）に撒き、37℃でOvernight

(2)BBa-1732019、BBa-1732950、BBa-K193602をそれぞれ、LBプレート（+amp）に白金耳を用いて、ストリークした。
　　　　　　　 　 　　 ↓
　　37℃でインキュベート　

(3)E4が15mLチューブに出切って、DNAが完全に溶出し終わってから、isopropanol 3.5mLを加えた
　　　　　　　　　　　　↓
　　15,000×g、4℃、30min　遠心
　　　　　　　　　　　　↓
　　遠心後、上清を捨てた
　　　　　　　　　　　　↓
　　37℃でインキュベートし、適度に乾燥（乾かしすぎない！）
　　　　　　　　　　　　↓
　　TE 50μLを加え、溶け切るまで冷蔵
　　　　　　　　　　　　↓
　　これの吸光度を計測した

(4)PoxyR、acrABのPCRを以下の組成で、テンプレートDNAを変えて行った
(組成)
PrimerF・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL
PrimerR・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・各1.5μL
テンプレートDNA（DH5α、JM109）・・・・・・1μL
Buffer for KOD-Plus・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL
2mM dNTPs・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・5μL
2mM MgSO4・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2μL
KOD-Plus（1U/μL）・・・・・・・・・・・・・・・・・・1μL
MilliQ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・33μL

(設定)
Pre　Denature・・・94℃、2min
Denature・・・・・・・94℃、15sec
Annealing・・・・・・62.8℃、30sec
Extension・・・・・・68℃、20sec
　　　　　　　　　　　　4℃、∞

PCR後、PoxyRとacrABを電気泳動によりチェックした

DNA量・・・・・・・・・・・5μL
Loading Buffer・・・・1μL
の割合で、1%アガロースゲルを用いて、100V、15min泳動した

【実験結果】
(3)吸光度の結果
　　　　　pSB6　　　　pSB1C3
1回目　 1.132　　　　0.155
2回目　 0.994　　　 0.138
3回目　 0.984　　　 0.126
4回目　 0.990　　　 0.122
5回目　 0.975　　　 0.125
平均　　 1.015　　　 0.1332
＊DNA1μLに対し、MilliQ99μLを加え。100倍希釈で測定

(4)写真参照