Template:KIT-Kyoto-Augsut20

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=== No title ===
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【時間】 9:00~<BR>
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【実験担当】福山、古道、竹内、革島<BR>
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【実験名】<BR>
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(1)8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測<BR>
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(2))DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]とDH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I]のプレカルチャー<BR>
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(3)2%アガロースゲルの作成<BR>
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(4)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ<BR>
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(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出<BR>
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【実験目的】<BR>
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(1)作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測<BR>
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(2)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出<BR>
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(3)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出<BR>
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【実験内容】<BR>
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(1)8/19(木)に以下条件で形質転換を行い、コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した<BR>
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pUC19・・・・・0.005ng/μL<BR>
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pUC19・・・・・0.05ng/μL<BR>
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pUC19・・・・・0.5ng/μL<BR>
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       ↓<BR>
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これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した<BR>
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(2)プレカルチャー<BR>
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DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)<BR>
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DH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I] を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)<BR>
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(3)2%アガロースゲルの作成<BR>
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<組成><BR>
 +
 ・1×TAE・・・・・・・・・・・・・・150mL<BR>
 +
 ・Ultra Pure Agarose・・・3g<BR>
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<手順><BR>
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 150mLの1×TAEに3gのUltra Pure Agaroseを加えレンジで10秒ごとに加熱し、完全に溶解する<BR>
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        ↓<BR>
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 60℃くらいに冷えたらトレイに流し込み、コームを差し込む<BR>
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        ↓<BR>
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 ゲルが固まったら1×TAEにつけて冷蔵保存する<BR>
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(4)<BR>
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培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mL<BR>
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  ↓4℃、15,000rpm、5min遠心<BR>
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上澄みをデカンテーションで取り除く<BR>
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  ↓<BR>
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菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)<BR>
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  ↓<BR>
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SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)<BR>
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  ↓5min on ice<BR>
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SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)<BR>
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  ↓5min on ice<BR>
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4℃、15,000rpm、10min遠心<BR>
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  ↓<BR>
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上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す<BR>
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  ↓<BR>
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等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える<BR>
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  ↓4℃、15,000rpm、20min遠心<BR>
 +
70%EtOHを1mL加える(vortex)<BR>
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  ↓4℃、15,000rpm、10min遠心<BR>
 +
上澄みを捨てる<BR>
 +
 ↓30sec 遠心乾燥<BR>
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RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする<BR>
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(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出<BR>
 +
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・材料<BR>
 +
 プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)<BR>
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1%アガロースゲル Seakem GTG Agarose 2枚<BR>
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TAE Buffer<BR>
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Buffer QG<BR>
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Isopropanol<BR>
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・実験操作<BR>
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50V、60minで電気泳動。<BR>
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          ↓<BR>
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1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。<BR>
 +
          ↓ <BR>
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EtBrを取り除いた。<BR>
 +
          ↓<BR>
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暗室、UV照射化でベクターの部分を切り出し、1.5mLエッペンに入れた。<BR>
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          ↓<BR>
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切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。<BR>
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pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g<BR>
 +
pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g<BR>
 +
          ↓<BR>
 +
ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた。<BR>
 +
pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL<BR>
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pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL<BR>
 +
          ↓ <BR>
 +
50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)<BR>
 +
             ↓<BR>
 +
溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた。<BR>
 +
          ↓<BR>
 +
カラムに移し替え、10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
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          ↓<BR>
 +
抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。<BR>
 +
          ↓<BR>
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10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
 +
          ↓<BR>
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Buffer PE 0.75mLを加えた。<BR>
 +
          ↓<BR>
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10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
 +
          ↓<BR>
 +
エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた。<BR>
 +
          ↓<BR>
 +
10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
 +
          ↓<BR>
 +
別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。<BR>
 +
(このエッペンの蓋は切っていない。)<BR>
 +
          ↓<BR>
 +
10,000rpm  1minで遠心した。<BR>
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          ↓<BR>
 +
別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈し、OD260を測った。<BR>
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【実験結果】<BR>
 +
(1)<BR>
 +
コロニー数<BR>
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pUC19・・・・・0.005ng/μL・・・・・0個<BR>     
 +
pUC19・・・・・0.05ng/μL・・・・・・97個     →1μLあたりのコロニー数は1940×10三乗個/μg<BR>
 +
pUC19・・・・・0.5ng/μL・・・・・・・1464個    →1μLあたりのコロニー数は2928×10三乗個/μg<BR>
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平均値・・・・・2.4×10六乗CFU/μg (DH5αのコンピテンシー)<BR>

Revision as of 02:33, 8 September 2010

August 20

No title

【時間】 9:00~

【実験担当】福山、古道、竹内、革島

【実験名】
(1)8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
(2))DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]とDH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I]のプレカルチャー
(3)2%アガロースゲルの作成
(4)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ
(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

【実験目的】
(1)作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
(2)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出
(3)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

【実験内容】
(1)8/19(木)に以下条件で形質転換を行い、コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した
pUC19・・・・・0.005ng/μL
pUC19・・・・・0.05ng/μL
pUC19・・・・・0.5ng/μL
       ↓
これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した

(2)プレカルチャー
DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)
DH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I] を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)

(3)2%アガロースゲルの作成
<組成>
 ・1×TAE・・・・・・・・・・・・・・150mL
 ・Ultra Pure Agarose・・・3g

<手順>
 150mLの1×TAEに3gのUltra Pure Agaroseを加えレンジで10秒ごとに加熱し、完全に溶解する
        ↓
 60℃くらいに冷えたらトレイに流し込み、コームを差し込む
        ↓
 ゲルが固まったら1×TAEにつけて冷蔵保存する

(4)
培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mL
  ↓4℃、15,000rpm、5min遠心
上澄みをデカンテーションで取り除く
  ↓
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
  ↓
SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)
  ↓5min on ice
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
  ↓5min on ice
4℃、15,000rpm、10min遠心
  ↓
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す
  ↓
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える
  ↓4℃、15,000rpm、20min遠心
70%EtOHを1mL加える(vortex)
  ↓4℃、15,000rpm、10min遠心
上澄みを捨てる
 ↓30sec 遠心乾燥
RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする

(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出

・材料
 プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)
1%アガロースゲル Seakem GTG Agarose 2枚
TAE Buffer
Buffer QG
Isopropanol
・実験操作
50V、60minで電気泳動。
          ↓
1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。
          ↓ 
EtBrを取り除いた。
          ↓
暗室、UV照射化でベクターの部分を切り出し、1.5mLエッペンに入れた。
          ↓
切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。
pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g
pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g
          ↓
ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた。
pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL
pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL
          ↓ 
50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)
          ↓
溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた。
          ↓
カラムに移し替え、10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
Buffer PE 0.75mLを加えた。
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた。
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。
(このエッペンの蓋は切っていない。)
          ↓
10,000rpm 1minで遠心した。
          ↓
別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈し、OD260を測った。

【実験結果】
(1)
コロニー数
pUC19・・・・・0.005ng/μL・・・・・0個
      pUC19・・・・・0.05ng/μL・・・・・・97個     →1μLあたりのコロニー数は1940×10三乗個/μg
pUC19・・・・・0.5ng/μL・・・・・・・1464個    →1μLあたりのコロニー数は2928×10三乗個/μg

平均値・・・・・2.4×10六乗CFU/μg (DH5αのコンピテンシー)