Template:KIT-Kyoto-Augsut20
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+ | (1)8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測<BR> | ||
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+ | (3)2%アガロースゲルの作成<BR> | ||
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+ | (1)作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測<BR> | ||
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+ | 【実験内容】<BR> | ||
+ | (1)8/19(木)に以下条件で形質転換を行い、コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した<BR> | ||
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+ | これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した<BR> | ||
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+ | (2)プレカルチャー<BR> | ||
+ | DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)<BR> | ||
+ | DH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I] を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)<BR> | ||
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+ | (3)2%アガロースゲルの作成<BR> | ||
+ | <組成><BR> | ||
+ | ・1×TAE・・・・・・・・・・・・・・150mL<BR> | ||
+ | ・Ultra Pure Agarose・・・3g<BR> | ||
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+ | <手順><BR> | ||
+ | 150mLの1×TAEに3gのUltra Pure Agaroseを加えレンジで10秒ごとに加熱し、完全に溶解する<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 60℃くらいに冷えたらトレイに流し込み、コームを差し込む<BR> | ||
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+ | ゲルが固まったら1×TAEにつけて冷蔵保存する<BR> | ||
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+ | (4)<BR> | ||
+ | 培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mL<BR> | ||
+ | ↓4℃、15,000rpm、5min遠心<BR> | ||
+ | 上澄みをデカンテーションで取り除く<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)<BR> | ||
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+ | SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)<BR> | ||
+ | ↓5min on ice<BR> | ||
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+ | 4℃、15,000rpm、10min遠心<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す<BR> | ||
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+ | 等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える<BR> | ||
+ | ↓4℃、15,000rpm、20min遠心<BR> | ||
+ | 70%EtOHを1mL加える(vortex)<BR> | ||
+ | ↓4℃、15,000rpm、10min遠心<BR> | ||
+ | 上澄みを捨てる<BR> | ||
+ | ↓30sec 遠心乾燥<BR> | ||
+ | RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする<BR> | ||
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+ | (5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出<BR> | ||
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+ | ・材料<BR> | ||
+ | プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)<BR> | ||
+ | 1%アガロースゲル Seakem GTG Agarose 2枚<BR> | ||
+ | TAE Buffer<BR> | ||
+ | Buffer QG<BR> | ||
+ | Isopropanol<BR> | ||
+ | ・実験操作<BR> | ||
+ | 50V、60minで電気泳動。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。<BR> | ||
+ | ↓ <BR> | ||
+ | EtBrを取り除いた。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 暗室、UV照射化でベクターの部分を切り出し、1.5mLエッペンに入れた。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。<BR> | ||
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+ | pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた。<BR> | ||
+ | pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL<BR> | ||
+ | pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL<BR> | ||
+ | ↓ <BR> | ||
+ | 50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | カラムに移し替え、10,000rpm 1minで遠心した。<BR> | ||
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+ | 抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 10,000rpm 1minで遠心した。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | Buffer PE 0.75mLを加えた。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 10,000rpm 1minで遠心した。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 10,000rpm 1minで遠心した。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。<BR> | ||
+ | (このエッペンの蓋は切っていない。)<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 10,000rpm 1minで遠心した。<BR> | ||
+ | ↓<BR> | ||
+ | 別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈し、OD260を測った。<BR> | ||
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+ | 【実験結果】<BR> | ||
+ | (1)<BR> | ||
+ | コロニー数<BR> | ||
+ | pUC19・・・・・0.005ng/μL・・・・・0個<BR> | ||
+ | pUC19・・・・・0.05ng/μL・・・・・・97個 →1μLあたりのコロニー数は1940×10三乗個/μg<BR> | ||
+ | pUC19・・・・・0.5ng/μL・・・・・・・1464個 →1μLあたりのコロニー数は2928×10三乗個/μg<BR> | ||
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+ | 平均値・・・・・2.4×10六乗CFU/μg (DH5αのコンピテンシー)<BR> |
Revision as of 02:33, 8 September 2010
August 20
No title
【時間】 9:00~
【実験担当】福山、古道、竹内、革島
【実験名】
(1)8/19(木)に作ったコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
(2))DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]とDH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I]のプレカルチャー
(3)2%アガロースゲルの作成
(4)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のアルカリミニプレップ
(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出
【実験目的】
(1)作成したコンピタントセル(DH5α)の形質転換効率の計測
(2)pSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)のプラスミドDNAの抽出
(3)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出
【実験内容】
(1)8/19(木)に以下条件で形質転換を行い、コンピタントセル(DH5α)をLB培地(+amp)で37℃,overnightで培養した
pUC19・・・・・0.005ng/μL
pUC19・・・・・0.05ng/μL
pUC19・・・・・0.5ng/μL
↓
これらのプレートに出たコロニー数を数え形質転換の効率を計測した
(2)プレカルチャー
DH5α-pSB1A2(l13522)[2-8A]を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)
DH5α-pSB1A2(R0040)[1-6I] を液体LB培地(+amp)2mLで培養(3本)
(3)2%アガロースゲルの作成
<組成>
・1×TAE・・・・・・・・・・・・・・150mL
・Ultra Pure Agarose・・・3g
<手順>
150mLの1×TAEに3gのUltra Pure Agaroseを加えレンジで10秒ごとに加熱し、完全に溶解する
↓
60℃くらいに冷えたらトレイに流し込み、コームを差し込む
↓
ゲルが固まったら1×TAEにつけて冷蔵保存する
(4)
培養後のpSB6A1(K121013)とpSB6A1(J04450)を1.5mL
↓4℃、15,000rpm、5min遠心
上澄みをデカンテーションで取り除く
↓
菌体ペレットを氷冷したSoltionⅠ100μLに懸濁(vortex)
↓
SolutionⅡ200μLを加え混合(vortex不可)
↓5min on ice
SolutionⅢ150μLを加え混合(vortex)
↓5min on ice
4℃、15,000rpm、10min遠心
↓
上澄みを新しい1.5mLマイクロチューブに移す
↓
等量(400μL)イソプロピルアルコールを加える
↓4℃、15,000rpm、20min遠心
70%EtOHを1mL加える(vortex)
↓4℃、15,000rpm、10min遠心
上澄みを捨てる
↓30sec 遠心乾燥
RNase in TE30μL加えてプラスミドDNAにする
(5)pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)のゲル抽出
・材料
プラスミドDNA(pSB6A1(J04450)とpSB3K3(J04450)
1%アガロースゲル Seakem GTG Agarose 2枚
TAE Buffer
Buffer QG
Isopropanol
・実験操作
50V、60minで電気泳動。
↓
1%アガロースゲルにEtBrを添加し20min染色。
↓
EtBrを取り除いた。
↓
暗室、UV照射化でベクターの部分を切り出し、1.5mLエッペンに入れた。
↓
切り出したゲルを1.5mLエッペンに入れ、重さを測った。
pSB6A1(J04450)・・・・・0.1923g
pSB3K3(J04450)・・・・・0.3637g
↓
ゲルの3倍量のBuffer QGを加えた。
pSB6A1(J04450)・・・・・0.5769mL
pSB3K3(J04450)・・・・・1.0911mL
↓
50℃のwater bathで10min incubateした。(4分毎にvoltex)
↓
溶解後ゲルと等量のisopropanolを加えた。
↓
カラムに移し替え、10,000rpm 1minで遠心した。
↓
抽出物を捨てBuffer QG 0.5mlを加えた。
↓
10,000rpm 1minで遠心した。
↓
Buffer PE 0.75mLを加えた。
↓
10,000rpm 1minで遠心した。
↓
エッペンの蓋を切りそこにカラムを移し替えた。
↓
10,000rpm 1minで遠心した。
↓
別のエッペンにカラムを乗せ換えMilliQ 37μL加えた。
(このエッペンの蓋は切っていない。)
↓
10,000rpm 1minで遠心した。
↓
別のチューブに5μL取り、そこにMilliQ 95μL加え20倍希釈し、OD260を測った。
【実験結果】
(1)
コロニー数
pUC19・・・・・0.005ng/μL・・・・・0個
pUC19・・・・・0.05ng/μL・・・・・・97個 →1μLあたりのコロニー数は1940×10三乗個/μg
pUC19・・・・・0.5ng/μL・・・・・・・1464個 →1μLあたりのコロニー数は2928×10三乗個/μg
平均値・・・・・2.4×10六乗CFU/μg (DH5αのコンピテンシー)