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(→September 11)
 
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== September 5 ==
== September 5 ==
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<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
 +
:9：30～
 +
 +
'''Member'''
 +
:岩城、竹内、吉村
 +
:Iwaki,Takeuchi,Yoshimura
 +
 +
'''Purpose'''
 +
# The insertion of a target plasmid is confirmed by pSB1C3(J04450) digestion by restriction enzymes.[Iwaki]
 +
# Isolation of pSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013) fragments from agarose gel.[Yoshimura,Takeuchi]
 +
# DNA ligation and Transformation.[Iwaki,Takeuchi]
 +
:(1)　前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を
 +
::制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した
 +
:(2)　プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)
 +
::インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出
 +
:(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション
 +
 +
'''Method'''
 +
:(1)　pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認
 +
::　前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した
 +
::　↓1.5 mlをチューブに採った
 +
::　↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μl加えた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
 +
::　↓上清をカラムに入れた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓カラムを新しいチューブに乗せ換えた
 +
::　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　それぞれ10 µlを別のチューブに採った
 +
::　↓H bufferを5 µl加えた
 +
::　↓蒸留水を34 µl加えた
 +
::　↓''EcoR''Ⅰと''Pst''Ⅰを0.5 µlずつ加えた
 +
::　↓37℃で1.5時間インキュベートした
 +
::　↓1 %ゲルを用いて、100 Vで25分間電気泳動した
 +
::　↓20分間EtBrで染色した
 +
::　↓紫外線を照射し写真を撮影した
 +
 +
:(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出
 +
<TABLE BORDER="0"><TR><TD ROWSPAN="2">
 +
::　PCR用のpSB6A1,RFP,pSB6A1を右表1,2の組成で平常通り制限酵素処理した
 +
::　↓右表3,4の組成でゲルにアプライした
 +
::　↓50Vで30分間電気泳動した
 +
::　↓UVを照射してゲルを切り出した
 +
::　↓H2O　400μLを加えた
 +
::　↓65℃　40minでヒートブロック
 +
::　↓Phe等量加えて　vortex
 +
::　↓cfg.　14500rpm　5min　25℃
 +
::　↓上清を新チューブへ
 +
::　↓Phe/Chl等量　voltex　　
 +
::　↓cfg.  14500rpm　5min　25℃
 +
::　↓上清を新チューブへ
 +
::　↓3M CH<SUB>3</SUB>COONa　50μLを加えた
 +
::　↓イソプロ　800μLを加えた
 +
::　↓cfg.　14500rpm　10min　4℃
 +
::　↓上清除き、70％EtOH 150μL
 +
::　↓cfg.　14500rpm    5min  4℃
 +
::　↓遠心乾燥機　5min
 +
::　↓MilliQ　10μLを加えた
 +
::</TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表1: PCR用pSB6A1</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNAsol</TD><TD>262μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>4μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Xba''Ⅰ</TD><TD>4μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer M</TD><TD>30μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>total</TD><TD>300μL</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表2: RFP,pSB6A1</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNAsol</TD><TD>85μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>2.5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>2.5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer H</TD><TD>10μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>total</TD><TD>100μL</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD></TR>
 +
::<TR><TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表3: PCR用のpSB6A1</TD>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA</TD><TD>300μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Orange Loading Dye</TD><TD>50μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表4: RFP,pSB6A1</TD>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA</TD><TD>100μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Orange Loading Dye</TD><TD>20μl</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
:(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション
 +
::　コンピテントセルにDNAを入れた
 +
::　↓20分間氷冷した
 +
::　↓43℃のウォーターバスに45秒間いれた
 +
::　↓5分間氷冷した
 +
::　↓SOC培地を900μl加えた
 +
::　↓20分間,37℃のインキュベーターに入れた
 +
::　↓13000rpm,4℃,1分間遠心した
 +
::　↓培養液を少し捨て量を減らし、ピペッティングした
 +
::　LBプレートにまき、37℃のインキュベーターに入れてovernight
 +
 +
 +
'''Results'''
 +
:(1)　以下のようにサンプルを泳動した
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>レーン1</TD><TD>1Kb Maker</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>レーン2</TD><TD>コロニー1から抽出したプラスミド</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>レーン3</TD><TD>コロニー1から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>レーン4</TD><TD>コロニー2から抽出したプラスミド</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>レーン5</TD><TD>コロニー2から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
::レーン2と4で同じ長さのバンドが確認できた
 +
::またレーン3と5では2本のバンドが確認でき、3と5で長さに違いはなかった
 +
:(2)　RFPのバンドが見られなかった
 +
:(3)　全てのプレートでコロニーの生育が見られた
 +
 +
'''Consideration'''
 +
:(1)　pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、
 +
::インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので
 +
::電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる
 +
::これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする
 +
:(2)　制限酵素処理に失敗したと思われる
== September 6 ==
== September 6 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
-
【時間】
+
'''Time'''
:8:30～20:30
:8:30～20:30
-
【実験担当】
+
'''Member'''
:岩城
:岩城
 +
:Iwaki
-
【実験目的】
+
'''Purpose'''
 +
# DNA miniprep of pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430) and pSB6A1(K121013).[Iwaki]
 +
# pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013) digestion by restriction enzymes.[Iwaki]
 +
# Isolation of pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430) and pSB6A1(K121013) fragments from agarose gel.[Iwaki]
 +
# Ligation of RFP-pSB6A1(K121013),CFP-pSB6A1(K121013) and YFP-pSB6A1(K121013).[Iwaki]
:(1)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する
:(1)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する
:(2)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する   
:(2)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する   
:(3)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出
:(3)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出
-
:(4)　RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える。AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する。
+
:(4)　RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える
 +
::AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する
   
   
-
【実験内容】
+
'''Method'''
:(1)　プラスミド抽出
:(1)　プラスミド抽出
::　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の
::　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の
Line 23: Line 183:
:(2)　制限酵素処理
:(2)　制限酵素処理
-
::　(1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
+
::　(1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)を''EcoR''Ⅰと''Pst''Ⅰの2種の制限酵素で切断した
::　(1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした
::　(1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした
-
::　RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
+
::　RFP,CFP.YFP用を''EcoR''Ⅰと''Pst''Ⅰの2種の制限酵素で切断した
-
::　promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した
+
::　promoter用を''EcoR''Ⅰと''Xba''Ⅰの2種の制限酵素で切断した
   
   
:(3)　ゲル抽出
:(3)　ゲル抽出
Line 39: Line 199:
::　LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした
::　LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした
-
【実験結果】
+
'''Results'''
::ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった
::ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった
::それ以外に関してはTFまで完了した
::それ以外に関してはTFまで完了した
Line 49: Line 209:
::　　pSB6A1(K362013)
::　　pSB6A1(K362013)
-
【実験考察】
+
'''Consideration'''
::試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い
::試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い
::確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる
::確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる
Line 55: Line 215:
== September 7 ==
== September 7 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
-
【時間】
+
'''Time'''
:9：00～
:9：00～
-
【実験担当】
+
'''Member'''
-
:岩城、竹内、中村、福山
+
:岩城、福山、竹内、中村
 +
:Iwaki,fukuyama,Takeuchi,Nakamura
-
【実験目的】
+
'''Purpose'''
-
:(1)　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP)),DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP)),
+
# Picking up single colony of pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507),pSB6A1(E0430),pSB6A1(K362011) and pSB6A1(K362039).[Fukuyama]
-
::DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP)),DH5α(pSB6A1(SodA,GFP)),
+
# Concentrate AcrAB by Phenol/chloroform and digestion by restriction enzymes.[Fukuyama]
-
::DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))のコロニーをピックアップ
+
# DNA miniprep of pSB1A2(I13507).[Fukuyama]
-
:(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理
+
# PCR of AcrAB.[Nakamura]
-
:(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮
+
# DNA miniprep of pSB1A2(I13507).[Iwaki,Takeuchi]
 +
# DNA miniprep of lacZ.[Takeuchi]
 +
:(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507),
 +
::pSB6A1(E0430),pSB6A1(K362011),
 +
::pSB6A1(K362039)のコロニーをピックアップ [福山]
 +
:(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理　[福山]
 +
:(3)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップと濃縮　[福山]
 +
:(4)　AcrABのPCR　[中村]
 +
:(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
 +
:(6)　lacZのアルカリミニプレップ
-
【実験内容】
+
'''Method'''
:(1)　コロニーをピックアップ
:(1)　コロニーをピックアップ
-
::　DH5α(pSB6A1(promoter less,CFP))
+
::　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507),
-
::　DH5α(pSB6A1(promoter less,RFP))
+
::pSB6A1(E0430),pSB6A1(K362011),
-
::　DH5α(pSB6A1(promoter less,YFP))
+
::pSB6A1(K362039)
-
::　DH5α(pSB6A1(SodA,GFP))
+
-
::　DH5α(pSB6A1(yaiA,GFP))
+
::　それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした
::　それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした
::　↓37℃でインキュベートした
::　↓37℃でインキュベートした
Line 96: Line 264:
::<TABLE BORDER="0"><TR>
::<TABLE BORDER="0"><TR>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
-
::<TD COLSPAN="2">＜表1＞吸光度計測結果</TD></TR>
+
::<TD COLSPAN="2">表1: 吸光度計測結果</TD></TR>
::<TR>
::<TR>
::<TD ROWSPAN="5">AD<SUB>260</SUB></TD><TD>0.071</TD></TR>
::<TD ROWSPAN="5">AD<SUB>260</SUB></TD><TD>0.071</TD></TR>
Line 112: Line 280:
::<TD></TD><TD></TD>
::<TD></TD><TD></TD>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
-
::<TD COLSPAN="2">＜表2＞試薬組成</TD></TR>
+
::<TD COLSPAN="2">表2: 試薬組成</TD></TR>
::<TR>
::<TR>
::<TD>AcrAB</TD><TD>24μl</TD></TR>
::<TD>AcrAB</TD><TD>24μl</TD></TR>
Line 129: Line 297:
-
:(3)　pSB1A2(BBa_I13507)のアルカリミニプレップと濃縮
+
:(3)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップと濃縮
-
::　DH5α(pSB6A1(promotor less,RFP))を1.5mlエッペンチューブにうつした
+
::　pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした
::　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
::　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
::　↓上清を捨てた
::　↓上清を捨てた
Line 158: Line 326:
::　↓MilliQを30μl加えた
::　↓MilliQを30μl加えた
-
【結果】
+
:(4)　AcrABのPCR
 +
::　下表1,2に示した試薬組成、設定に従ってPCRを行った
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>組成</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>AcrABM</TD><TD>1.5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>dNTPs</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>KOD-Plus</TD><TD>1μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>4μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>鋳型DNA</TD><TD>0.5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>33μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>50μL</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">PCR設定</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>熱変性</TD><TD>熱変性</TD><TD>アニーリング</TD><TD>伸長反応</TD><TD>伸長反応</TD><TD>保存</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>60.2℃</TD><TD>68℃</TD><TD>68℃</TD><TD>4℃</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>5min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>20sec</TD><TD>2min</TD><TD>∞</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD></TD><TD COLSPAN="3"><CENTER>30サイクル</CENTER></TD><TD></TD><TD></TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 
 +
:(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
 +
::　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ
 +
::　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μl加えた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
 +
::　↓上清をカラムに入れた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
 +
::　↓電気泳動した
 +
 
 +
:(6)　lacZのアルカリミニプレップ
 +
::　集菌後、水分を十分に取り除き、SolutionⅠ250μLを加えた
 +
::　↓vortexにより混合した後、SolutionⅡ250μLを加え、上下に2，3度転倒させて混ぜた
 +
::　↓SolutionⅢ350μLを加え、よく混合した
 +
::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min
 +
::　↓上清をカラムに移した
 +
::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　30sec　カラム下部の液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣ500μLを加えた
 +
::　↓cfg.　20℃　13,000rpm　1min　カラム下部の液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤ700μLを加えた
 +
::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　1min×２
 +
::　↓酢酸ナトリウム50μL、イソプロパノール800μLを加えた
 +
::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　10min
 +
::　↓上清を除いた
 +
::　↓70%EtOHをエッペンの8分目まで加えた
 +
::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min
 +
::　↓遠心乾燥　2min
 +
::　↓滅菌水100μLに溶かした
 +
 
 +
'''Results'''
:(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した
:(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した
:(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない
:(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない
Line 164: Line 409:
:(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
:(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
::翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う
::翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う
 +
:(4)　ゲル抽出をするのに十分な濃度の試料を得ることができた。
 +
:(5)　バンドは検出できなかった、iGEMの製作した試薬には問題ありと考えられる
 +
:(6)　lacZの吸光度は0,1468（×1/100）でDNA濃度は734g/μLであった
 +
::　　　→冷蔵保存
== September 8 ==
== September 8 ==
-
 
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
 +
:9：00～
-
== September 9 ==
+
'''Member'''
 +
:岩城、福山、古道、竹内、中村
 +
:Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Nakamura
 +
'''Purpose'''
 +
# DNA miniprep of pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420) and pSB1A2(E0430).And concentration of those.[Fukuyama]
 +
# Cultivate pSB6A1（E0420).[Fukuyama]
 +
# PCR of SodA,OxyR and yaiA.[Furumichi]
 +
# SodA,OxyR and yaiA concentrate by phenol/chloroform.[Furumichi]
 +
# 2-propanol precipitation of pSB1C3.[Nakamura]
 +
:(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮
 +
:(2)　pSB6A1（E0420）の培養
 +
:(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR
 +
:(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理
 +
:(5)　pSB1C3のイソプロ沈
 +
 +
'''Method'''
 +
:(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮
 +
::　4時間ほどLB液体培地で培養した各''E.Coli''をそれぞれ1.5mlエッペンに8割ほど移した
 +
::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μl加えた
 +
::　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓上清をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓滅菌水をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓溶出液を回収
 +
::　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して
 +
::　　それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
 +
::　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
 +
::　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。
 +
::　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
 +
::　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
 +
::　↓MilliQを各種プラスミドにつき30μlずつ加えた
 +
 +
:(2)　pSB6A1（E0420）の培養
 +
::　前日にAmp入りLB寒天培地にストリークしたpSB6A1(E0420)を
 +
::　2mlのLB液体培地が入った試験管6本に一部うつして　　　　　
 +
::　振とう培養した
 +
 +
:(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR
 +
::　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を
 +
::　すでにMixしたプライマー(SodA, OxyR,yaiA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
 +
::　↓それぞれのエッペンに下表1の組成で溶液を加えた
 +
::　↓下表2,3のプログラムでPCR反応を行った
 +
::　↓PCR産物を電気泳動にかけた
 +
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>表1: 試薬組成</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>テンプレートDNA(DH5α)</TD><TD>各0.5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>10×PCR Buffer for KOD-Plus-</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2mM d NTPs</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2mM MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>4μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>MilliQ</TD><TD>33μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>KOD-Plus-</TD><TD>1μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>total</TD><TD>50μL</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="3">表2: SodA,OxyRのPCR反応</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>熱変性</TD><TD>熱変性</TD><TD>アニーリング</TD><TD>伸長反応</TD><TD>伸長反応</TD><TD>保存</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>62.7℃</TD><TD>68℃</TD><TD>68℃</TD><TD>4℃</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>1min</TD><TD>2min</TD><TD>保持</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD></TD><TD COLSPAN="3">30サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="3">表3: yaiAのPCR反応</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>熱変性</TD><TD>熱変性</TD><TD>アニーリング</TD><TD>伸長反応</TD><TD>伸長反応</TD><TD>保存</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>60.4℃</TD><TD>68℃</TD><TD>68℃</TD><TD>4℃</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2min</TD><TD>15sec</TD><TD>30sec</TD><TD>38sec</TD><TD>2min</TD><TD>保持</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD></TD><TD COLSPAN="3">30サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
:(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理
 +
::　PCR済のSodA, OxyR,yaiAにそれぞれ200µlずつ滅菌水を加えた
 +
::　↓フェノールクロロホルム(φ OH/CIAA)200µl加えた
 +
::　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した
 +
::　↓上清を回収しそれにクロロホルムイソアミルアルコール(CIAA)を200µl加えボルテックスした
 +
::　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した
 +
::　↓上清を回収しそれに3M CH<SUB>3</SUB>COONaを50µl加え混ぜた
 +
::　↓イソプロパノール0.5ml加えて混ぜ4℃、14,000rpmで20min遠心した
 +
::　↓上澄みを捨て70％エタノール200µl加え4℃、14,000rpmで10min遠心した
 +
::　↓上澄みを捨てて乾燥させた
 +
::　↓滅菌水を30µl加えた
 +
::　↓冷蔵保存した
 +
 +
:(5)　pSB1C3のイソプロ沈
 +
::　TEに溶かした状態のpSB1C3ベクター50μLに、CH<SUB>3</SUB>COONa50μL、イソプロパノール800μLを加えた
 +
::　↓cfg.　25℃　13,000rpm　15min
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓70%EtOH800μLを加えた
 +
::　↓cfg.　25℃　14,500rpm　5min
 +
::　↓EtOHを除いた
 +
::　↓遠心乾燥　2min
 +
::　↓滅菌水30μLに溶かした
 +
 +
'''Results'''
 +
:(1)　まだどれほどの量でプラスミドが回収できたのかは分からない
 +
:(2) 培養に成功していれば明日にもアルカリミニプレップを行う予定
 +
:(3)　PCR産物を電気泳動にかけた結果、すべて、バンドが検出されたので、今後使用するものとする
 +
:(4)　実験(3)で得られたPCR産物のクロロホルム処理を行い冷蔵保存した
 +
::これを次回の実験に用いる(制限酵素処理など)
 +
:(5)冷蔵保存
 +
 +
== September 9 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
 +
:9：00～
 +
 +
'''Member'''
 +
:竹内、中村、吉村
 +
:Takeuchi,nakamura,Yoshimura
-
== September 10 ==
+
'''Purpose'''
 +
# DNA miniprep of pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507).[Yoshimura]
 +
# Isolation of pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430) and pSB1A2(R0040) fragments from agarose gel.[Yoshimura]
 +
# Absorbance determination of oxyR, sodA, and yaiA.[Nakamura]
 +
:(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出　[吉村]
 +
:(2)　(1)と前日(9/8)にプラスミド抽出した
 +
::pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出　[吉村]
 +
::(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定　[中村]
 +
'''Method'''
 +
:(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出
 +
::　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした
 +
::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μl加えた
 +
::　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓上清をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓滅菌水をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓溶出液を回収
 +
::　↓CH<SUB>3</SUB>COONaとイソプロパノールを
 +
::　　溶出液量に対してそれぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
 +
::　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
 +
::　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
 +
::　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
 +
::　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
 +
::　↓MilliQを30μl加えた
 +
 +
 +
:(2)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出
 +
::　今回は青ゲルを使わずにUV照射でバンドの位置を確認してゲル抽出を行う方法をとった
 +
::　DNAを下表1,2,3のように制限酵素処理した
 +
::　↓3時間,37℃でインキュベート
 +
::　↓アガロースゲルに下表4の全量をapplyした
 +
::　↓50V,50minで電気泳動した。
 +
::　↓20min EtBrに浸した
 +
::　↓暗室でUVをゲルに照射し、バンドの位置を確認してゲルを切り出した
 +
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>表1: CFP</TD>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA</TD><TD>40μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Xba''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>M Buffer</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>milliQ</TD><TD>2μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>total</TD><TD>50μl</TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>表2: RFP,YFP</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA</TD><TD>30μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Xba''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>M Buffer</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>milliQ</TD><TD>12μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>total</TD><TD>50μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>表3: TetR</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA</TD><TD>30μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H Buffer</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>milliQ</TD><TD>12μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>total</TD><TD>50μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD VALIGN="bottom"><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>表4: 試薬組成</TD>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Marker(1kb)</TD><TD>3μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Loadiing Buffer</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA</TD><TD>全量</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
::(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定
 +
::冷蔵保存されていたoxyR、sodA、yaiA on pSB6A1をそれぞれ、100倍希釈で吸光度測定した
 +
 +
'''Results'''
 +
:(2,3)　CFP,YFP,TetRはバンドが見え、切り出しに成功した
 +
::　⇒冷蔵庫に保存、翌日のLigationに使用する
 +
::　RFPはバンドが見えなかった
 +
::　⇒ミニプレの必要あり
 +
:(4)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定結果(100倍希釈)
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD></TD><TD>吸光度</TD><TD>DNA濃度</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>oxyR</TD><TD>0.018(5回平均)</TD><TD>90ng/μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>sodA</TD><TD>0.058(5回平均)</TD><TD>290ng/μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>yaiA</TD><TD>0.029(5回平均)</TD><TD>145ng/μL</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
== September 10 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
 +
:9：00～
-
== September 11 ==
+
'''Member'''
 +
:福山、竹内、臼井、吉村
 +
:Fukuyama,Takeuchi,Usui,Yoshimura
 +
'''Purpose'''
 +
# Cultivate of pSB1A2(I13522) and pSB1A2(J04450).[Usui]
 +
# Ligation of pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430) and pSB1A2(R0040).[Yoshimura]
 +
# Activity of ahpC and sufA is examined.[Usui]
 +
# All promoter digestion by restriction enzymes.[Usui]
 +
# DNA miniprep of pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450) and pSB1A2(I13522).And concentration of those.[Fukuyama]
 +
# To examine the promoter activity in the opposite direction of OxyR, Inverted LacZ is made by PCR. [Yoshimura]
 +
:(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)の培養　[臼井]
 +
:(2)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション　[吉村]
 +
:(3)　ahpC,sufAの活性確認　[臼井]
 +
:(4)　全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理　[臼井]
 +
:(5)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮　[福山]
 +
:(6)　OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する　[吉村]
 +
 +
'''Method'''
 +
:(1)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450)の培養
 +
::　pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)をマスタープレートより白金耳でひっかき、
 +
::　LB(+amp)の培地3mLで各3本ずつ37℃で培養した
 +
 +
:(2)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション
 +
::[1] CFP,RFP,YFP,TetR-GFPのDNAのゲルからの抽出
 +
 +
::　切りだしたゲルを入れたエッペンに400μlのmilliQを入れた
 +
::　↓65℃でゲルを溶かした
 +
::　↓フェノールをエッペンの8割くらいまでいれて、vortexした
 +
::　↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した
 +
::　↓上清を回収し、フェノールクロロホルムをエッペンの8割くらいまで加えた
 +
::　↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した
 +
::　↓上清を回収し、イソプロパノール 800μl,CH<SUB>3</SUB>COONa 50μlを加えた
 +
::　↓14,500rpm,10min,4℃で遠心した
 +
::　↓70％EtOH 200μlを加えた
 +
::　↓14,500rpm,3min,4℃で遠心した
 +
::　↓遠心乾燥器にかけた
 +
::　↓30μlのmilliQに溶かした後吸光度を測定しDNA濃度を調べた
 +
 +
::[2] pSB6A2(k121013)とpSB1A2(I13522)のligation
 +
::　ligationはT-4ligaseを用いて以下の条件で行った
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="3">A(insert:vector=1:2)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Insert(TetR-GFP)</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(pSB6)</TD><TD>7.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>MilliQ</TD><TD>0μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10.8μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">B(insert:vector=1:10)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Insert(TetR-GFP)</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(pSB6)</TD><TD>4.2μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>MilliQ</TD><TD>3μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
::　A、B両サンプルをそれぞれ16℃で1時間インキュベートした
 +
::　以上の2サンプルについては以下の条件でトランスフォーメーションを行った
 +
::　　DH5α50μlに以上の2サンプル全量を加え混ぜた後、30分間氷上で静置した
 +
::　　↓43℃で40秒インキュベートした後、10分間氷上で静置した
 +
::　　↓この各サンプルをLBプレート(+amp　終濃度50μg/ml)にまき37℃でインキュベートした(overnight)
 +
 +
 +
:(3)　ahpC,sufAの活性確認
 +
::　ahpC,sufAに関して100倍希釈の吸光度5回測定し、平均値より各濃度を算出した
 +
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>ahpC</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>1回目</TD><TD>0.211</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2回目</TD><TD>0.210</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>3回目</TD><TD>0.204</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>4回目</TD><TD>0.200</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>5回目</TD><TD>0.198</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Ave</TD><TD>0.2046</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">濃度1023ng/μL</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>sufA</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>1回目</TD><TD>0.161</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2回目</TD><TD>0.164</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>3回目</TD><TD>0.165</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>4回目</TD><TD>0.160</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>5回目</TD><TD>0.159</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Ave</TD><TD>0.1618</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">濃度809ng/μL</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
:(4)　全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理
 +
::　ahpC(全量240μL),AcrAB(全量45μL),dps(全量195μL),SodA(全量135μL),
 +
::　sufA(全量240μL),oxyR(全量45μL),yaiA(全量135μL)の七種類のプロモーターに関して、
 +
::　濃縮を以下の手順で行い、制限酵素処理を行った
 +
 +
::[濃縮]
 +
::　DNA溶液の全量をxμLとして、DNA溶液に1/10x μL　3M CH<SUB>3</SUB>COONa,x μL　isopropanolを加えた
 +
::　↓cfg.14000rpm,20min,4℃
 +
::　↓上清を捨て、70%EtOHを加えた
 +
::　↓cfg.14000rpm,10min,4℃
 +
::　↓上清を捨て遠心乾燥 30sec.
 +
::　↓それぞれのDNAにH<SUB>2</SUB>O 30μLを加えた
 +
 +
::[制限酵素処理]
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>＜組成＞</TD>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNAサンプル</TD><TD>30μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>10×H-Buffer</TD><TD>4μL(1×として使用)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>0.4μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Spe''Ⅰ</TD><TD>0.2μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>5.4μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>40μL</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
::　これを37℃,overnightで培養した
 +
 +
 +
:(5)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮
 +
::pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)を
 +
::それぞれ別々に1.5mlエッペンチューブにうつした
 +
::　↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μl加えた
 +
::　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓上清をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓滅菌水をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓溶出液を回収
 +
::　↓CH<SUB>3</SUB>COONaとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
 +
::　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
 +
::　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
 +
::　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
 +
::　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
 +
::　↓TE(10μlTris-HCl pH8.0/1mM EDTA)をそれぞれ30μlずつ加え、冷蔵庫で保管した
 +
 +
:(6)　OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する
 +
 +
::[1]Inverted LacZ 作成のためのPCR
 +
::　鋳型DNAとしてiGEMで登録されているpSB1A2(I732019)を用いた
 +
::　PCRの条件は以下の条件で行った
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">Sample A</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>鋳型DNA(810ng/ul)</TD><TD>0.5ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>1ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>dNTP</TD><TD>2ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>KODplus</TD><TD>0.5ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Primer(forward)</TD><TD>0.5ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Primer(Reverse)</TD><TD>0.5ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>2ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>MilliQ</TD><TD>13ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>20ul</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">Sample B</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>鋳型DNA(810ng/ul)</TD><TD>0.5ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>2ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>dNTP</TD><TD>2ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>KODplus</TD><TD>0.5ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Primer(forward)</TD><TD>0.5ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Primer(Reverse)</TD><TD>0.5ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>2ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>MilliQ</TD><TD>12ul</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>20ul</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD VALIGN="bottom"><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="3">PCR反応</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>熱変性</TD><TD>熱変性</TD><TD>アニーリング</TD><TD>伸長反応</TD><TD>伸長反応</TD><TD>保存</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>63℃</TD><TD>75℃</TD><TD>75/TD><TD>4℃</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2min</TD><TD>30sec</TD><TD>30sec</TD><TD>30sec</TD><TD>10min</TD><TD>保持</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD></TD><TD COLSPAN="3">35サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
::　合成したプライマーを以下に示した
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD>Primer(forward)</TD><TD>5’-CAGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGTATAAACGCAGAAAGGCCCA</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Primer(Reverse)</TD><TD>5’-ACGTACTAGTAGCGGCCGCTGCAGAAAGAGGAGAAATACTAGAT</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
::　以上の条件によりPCRで増幅させたサンプルを電気泳動し、増幅の確認を行った
 +
 +
'''Results'''
 +
:(1)　翌日、培養の成功を確認した
 +
:(2) それぞれのDNA濃度を以下にまとめた
 +
::　　　CFP 280ng/μl
 +
::　　　YFP 450ng/μl
 +
::　　　TetR－GFP 400ng/μl
 +
::翌日コロニーができていた
 +
:(3) 濃度の測定で十分量と判断し、以後の実験に使用した
 +
:(4) 翌日11日に結果記載
 +
:(5) どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
 +
::明日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う
 +
:(6) Ⅰのサンプルではバンドがみられなかったが、Ⅱのサンプルではバンドが見えた
 +
::　　　⇒Ⅱのサンプルでバンドが見られたことから、次回からPCRするにはⅡの条件で行うのがよい
 +
::TetR-GFPのインサートが937bpなので、今回得られたバンドは少しそれより長いものと考えられる
 +
::急ぎなのでこのまま使用するが、本来ならカットチェックを行う必要がある
 +
 +
== September 11 ==
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
<div align="right"><span style="font-size:10pt;">[[#notebook|>>top]]</span></div>
 +
'''Time'''
 +
:9：00～
 +
 +
'''Member'''
 +
:福山、古道、竹内、臼井、革島、中村
 +
:Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Kawashima,Nakamura
 +
 +
'''Purpose'''
 +
# Picking up single colony of pSB6A1(I13522) and DNA miniprep of pSB6A1(I13522).[Takeuchi]
 +
# Streaking of pSB6A1(I13522).[Furumichi]
 +
# Cultivate of pSB6A1(K362036) and miniprep of this and digestion by restriction enzymes.[Usui]
 +
# PCR of lacZ and digestion by restriction enzymes .[Takeuchi]
 +
# Isolation of promoter fragments from agarose gel.[Furumichi]
 +
# DNA miniprep of lacZ and digestion by restriction enzymes.[Takeuchi]
 +
# Pre-culture of pSB1A2(I13522),pSB6A1(K121013),pSB6A1(I13522).[Kawashima]
 +
# Measurement of absorbance of pSB6A1(J04450),pSB6A1(I13507) and pSB1A2(I13522) and digestion by restriction enzymes.[Kawashima]
 +
# DNA miniprep of pSB6A1(K362036).[Fukuyama]
 +
# Isolation of SodA,sufA,ahpC,oxyR and dps fragments from agarose gel.[Usui]
 +
# Ligation of SodA,sufA,ahpC,oxyR and dps.[Usui]
 +
:(1)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のピックアップ、ミニプレップ　[竹内]
 +
:(2)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のストリーク　[古道]
 +
:(3)　pSB6A1(K362036)の培養6本→アルカリミニプレップ→制限酵素処理(over night)　[臼井]
 +
:(4)　LacZ(inverted)のPCR2本、35サイクル→制限酵素処理(over night)　[竹内]
 +
:(5)　Promoterのゲル抽出(全種類)　[古道]
 +
:(6)　プロモーターレスLacZの ミニプレ→制限酵素処理　[竹内]
 +
:(7)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(K121013),pSB6A1(I13522)のプレカルチャー　[革島]
 +
:(8)　前日にアルカリミニプレップした
 +
::pSB6A1(J04450),pSB6A1(I13507),pSB1A2(I13522)
 +
::の吸光度の測定と制限酵素処理　[革島]
 +
:(9) pSB6A1(K362036)のアルカリミニプレップ　[福山]
 +
:(10)　AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの電気泳動　[福山]
 +
:(11)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのゲル抽出　[臼井]
 +
:(12)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのライゲーション　[臼井]
 +
 +
'''Method'''
 +
:(1)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のピックアップ、ミニプレップ
 +
::　ライゲーション済pSB6A1(I13522)をピックアップした
 +
::　↓4時間程37℃振とう培養した
 +
::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μl加えた
 +
::　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓上清をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた<!--今更だけども抽出液は捨てちゃダメな気がする。捨てるんは上清じゃないかな-->
 +
::　↓滅菌水をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓溶出液を回収
 +
 +
:(2)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のストリーク
 +
::　amp入りLBプレートにライゲーション済pSB6A1(I13522)をストリークした
 +
 +
:(3)　pSB6A1(K362036)の培養6本→アルカリミニプレップ→制限酵素処理(over night)
 +
::　試験管で培養した試料をカラムなしのミニプレ処理を行いDNAを抽出した
 +
::　そして、抽出後の試料にEcoRⅠ,PstⅠでの制限酵素処理を行った
 +
::　組成を下表1に示した
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表1: 制限酵素処理組成</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNAsol</TD><TD>3μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD>1μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Pst''Ⅰ</TD><TD>1μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>10×H</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>H<SUB>2</SUB>O</TD><TD>40μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>50μL</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
:(4)　LacZ(inverted)のPCR2本、35サイクル→制限酵素処理(over night)
 +
::　Inverted lacZのPrimer(forward)1.5μl、Primer(Revese)1.5μlを500μlエッペンに分注した
 +
::　↓それぞれのエッペンに下表2の組成で溶液を加えた
 +
::　↓下表3に示したプログラムでPCR反応を行った
 +
::　↓PCR済のInverted lacZの吸光度測定し、DNA濃度を算出した
 +
::　↓下表4の組成でエッペンに分注し、制限酵素処理を行った
 +
::　↓これを37℃でインキュベートした(overnihgt)
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表2: 試薬組成</TD>
 +
::<TR>
 +
::<TD>pSB1A2(BBa-I732019)</TD><TD>各 1μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>10×PCR Buffer for KOD-Plus-</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2mM d NTPs</TD><TD>5μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2mM MgSO<SUB>4</SUB></TD><TD>4μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>MilliQ</TD><TD>31μL</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>KOD-Plus-</TD><TD>1μL</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="3">表3: PCR反応</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>熱変性</TD><TD>熱変性</TD><TD>アニーリング</TD><TD>伸長反応</TD><TD>伸長反応</TD><TD>保存</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>94℃</TD><TD>94℃</TD><TD>63℃</TD><TD>75℃</TD><TD>75℃</TD><TD>4℃</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>2min</TD><TD>30sec</TD><TD>30sec</TD><TD>30sec</TD><TD>10min</TD><TD>保持</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD></TD><TD COLSPAN="3">35サイクル</TD><TD></TD><TD></TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表4: 制限酵素処理</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>PCR済Inverted lacZ</TD><TD></TD><TD>A</TD><TD>B</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA</TD><TD></TD><TD>40μl</TD><TD>40μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD></TD><TD>1.796μl</TD><TD>0.94μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Spe''Ⅰ</TD><TD></TD><TD>0.997μl</TD><TD>0.522μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer H</TD><TD></TD><TD>5μl</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD></TD><TD>2.207μl</TD><TD>3.538μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>total</TD><TD></TD><TD>50μl</TD><TD>50μl</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
:(5)　Promoterのゲル抽出(全種類)
 +
AcrAB,ahpC,dps,oxyR,,SodA,sufA,yaiA過酸化水素応答性プロモーター7種類に対して
 +
カラムを使わないゲル抽出を行った
 +
 +
:(6)　プロモーターレスLacZの ミニプレ→制限酵素処理
 +
::　遠心1分(20℃、14,000rpm)して集菌(菌液を使いきるまで)
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、よくボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μl加えた
 +
::　↓遠心5分(20℃、14,000rpm)
 +
::　↓上清をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,000rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓滅菌水をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓溶出液を回収
 +
 +
::　プロモーターレスLacZの制限酵素処理
 +
::　''EcoR''Ⅰ、''pst''Ⅰでカット。Total50μL
 +
 +
 +
:(7)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(K121013),pSB6A1(I13522)のプレカルチャー
 +
::　プレートを4分割してそれぞれをストリーク、1つはNothingとした
 +
::　↓37℃でインキュベートした(over night)
 +
 +
:(8)　pSB6A1(J04450),pSB6A1(I13507),pSB1A2(I13522)
 +
::の吸光度の測定と制限酵素処理
 +
::　前日にアルカリモニプレップと濃縮を終えていた3試料を100倍希釈して吸光度(260nm)を測定した
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>試料A</TD><TD>pSB6A1(BBa_J04450,RFP)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>試料B</TD><TD>pSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>試料C</TD><TD>pSB1A2(BBa_I13522,TetR)</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
::　↓下表5に従い試料を調整した
 +
::　↓37℃でインキュベート
 +
::<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD COLSPAN="2">表5: 試薬組成</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD></TD><TD></TD><TD>試料B(μl)</TD><TD>試料C(μl)</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>DNA溶液</TD><TD></TD><TD>29</TD><TD>29</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''EcoR''Ⅰ</TD><TD></TD><TD>0.15</TD><TD>0.8</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Spe''Ⅰ</TD><TD></TD><TD>0.085</TD><TD></TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>''Xba''Ⅰ</TD><TD></TD><TD></TD><TD>0.89</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer H</TD><TD></TD><TD>5</TD><TD>5</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD></TD><TD>15.8</TD><TD>14.31</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>合計</TD><TD></TD><TD>約50</TD><TD>約50</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
 +
:(9) pSB6A1(K362036)のアルカリミニプレップ
 +
::　遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
 +
::　↓上清を捨てた
 +
::　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
 +
::　↓SolutionⅡを250μl加えた
 +
::　↓SolutionⅢを350μl加えた
 +
::　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓上清をカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓抽出液を捨てた
 +
::　↓滅菌水100μlをカラムに入れた
 +
::　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
 +
::　↓溶出液を回収した
 +
 +
:(10)　AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの電気泳動
 +
::　前日(10日)にEcoRⅠ-SpeⅠでカットしておいた
 +
::　AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの七種類のプロモーターに関して
 +
::　1%アガロースゲル(ゲル抽出用)で50V-45minの条件で電気泳動を行った
 +
 +
:(11)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのゲル抽出
 +
:＜方法＞
 +
::　抽出(QIAGENのQIAquick®Gel Extraction kit(250)を使用)
 +
 +
::　切りだしたゲルの重さを事前に量った
 +
::　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート
 +
::　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
 +
::　↓cfg.10,000rpm-1min
 +
::　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた。
 +
::　↓cfg.10,000rpm-1min
 +
::　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた。
 +
::　↓cfg.10,000rpm-1min
 +
::　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた。
 +
::　↓cfg.10,000rpm-1min
 +
::　↓内5μLを濃度測定に使用した(H2Oを95μL加え20倍希釈とした)
 +
 +
:(12)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのライゲーション
 +
::　CFP-On pSB6(ローコピーベクター)、各種プロモーターおよび、
 +
::　YFP-On pSB6(ローコピーベクター)、各種プロモーターのligation
 +
::　ligationはT-4lagaseを用いligation条件を以下の条件で行った
 +
 +
:CFP-on pSB6,各種プロモーターのligation
 +
 +
::[Ⅰ] insert:vector=1:2
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(sufA)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>2.4μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>0.2μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(sodA)</TD><TD>6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>1.3μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>0.9μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(ahpC)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>2.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>0.7μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(oxyR)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>3.4μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>0μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insent(dps)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>3.6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>0.2μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
 +
 +
:YFP on pSB6,各種プロモーターのligation
 +
 +
::[Ⅰ] insert:vector=1:2
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(sufA)</TD><TD>6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>1.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>0.4μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(sodA)</TD><TD>6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>1.4μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(ahpC)</TD><TD>6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>1.9μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>0.3μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(oxyR)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>2.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>0.7μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insent(dps)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>2.7μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>0.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
 +
 +
:CFP-on pSB6,各種プロモーターのligation
 +
 +
::[Ⅱ] insert:vector=1:5
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(sufA)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>2.2μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(sodA)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>0.4μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>2.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(ahpC)</TD><TD>6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>1.2μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(oxyR)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>1.4μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>2.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insent(dps)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>1.5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>2.7μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
 +
 +
:YFP-on pSB6,各種プロモーターのligation
 +
 +
::[Ⅱ] insert:vector=1:5
 +
::<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(sufA)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>0.6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>2.6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(sodA)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>0.3μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>2.9μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(ahpC)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>0.6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>2.6μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insert(oxyR)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>0.85μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>2.35μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE></TD>
 +
::<TD></TD><TD></TD>
 +
::<TD><TABLE BORDER="1"><TR>
 +
::<TD>Insent(dps)</TD><TD>5μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Vevtor(CFP-On pSB6)</TD><TD>0.9μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Buffer</TD><TD>1μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>T-4ligase</TD><TD>0.8μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Milli Q</TD><TD>2.3μl</TD></TR>
 +
::<TR>
 +
::<TD>Total</TD><TD>10μl</TD></TR>
 +
::</TABLE>
 +
::</TD></TR></TABLE>
 +
 +
::以上の条件で作成したすべてのサンプルについてトランスフォーメーションを行い大腸菌に形質転換させた
 +
 +
::　DH5α50μlに以上のサンプル全量をそれぞれ加え混ぜた後、3min氷上で静置した
 +
::　↓43℃で30秒インキュベートした後、10分間氷上で静置した
 +
::　↓この各サンプルをLBプレート(+amp 終濃度50μg/ml)にまき37℃でインキュベートした(overnight)
 +
 +
'''Results'''
 +
:(1)　ライゲーション済TetR・GFPのミニプレップ処理後は保存し、次回吸光度測定をした
 +
:(2)　翌日生えていた
 +
:(3)　十分な量のDNAを抽出できたので予定通り、制限酵素処理を行った。
 +
:(4)
 +
:<TABLE BORDER="0"><TR>
 +
:<TD><TABLE BORDER="0"><TR>
 +
:<TD COLSPAN="2">PCR済Inverted lacZ①吸光度(100倍希釈)</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD ROWSPAN="5"></TD><TD>0.094</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.090</TD>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.089</TD>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.091</TD>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.085</TD>
 +
:<TR>
 +
:<TD>平均</TD><TD>0.0898</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>DNA濃度</TD><TD>4.49×10<SUP>2</SUP>(µl/ml)</TD></TR>
 +
:</TABLE></TD>
 +
:<TD></TD><TD></TD>
 +
:<TD><TABLE BOEDER="0"><TR>
 +
:<TD COLSPAN="2">PCR済Inverted lacZ①吸光度(100倍希釈)</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD ROWSPAN="5"></TD><TD>0.050</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.046</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.048</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.050</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.041</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>平均</TD><TD>0.0470</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>DNA濃度</TD><TD>2.35×10<SUP>2</SUP>(µl/ml)</TD></TR>
 +
:</TABLE>
 +
:</TD></TR></TABLE>
 +
 +
::制限酵素処理後はDNA抽出を行う
 +
 +
:(5)　AcrAB,ahpC,dps,oxyR,,SodA,sufA,yaiAのうちAcrAB,ahpC,sufAがゲル抽出に成功した
 +
::ゲル抽出に成功した試料の濃度は以下の通り
 +
:<TABLE BOEDER="1"><TR>
 +
:<TD></TD><TD>AcrAB</TD><TD>ahpC</TD><TD>sufA</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>濃度</TD><TD>28 ng/μL</TD><TD>1238 ng/μL</TD><TD>640 ng/μL</TD></TR>
 +
:</TABLE>
 +
 +
:(6)　プロモーターレスLacZの ミニプレ
 +
:<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
:<TD></TD><TD>Sample1(1/20)</TD><TD>Sample2(1/20)</TD><TD>Sample3(1/200)</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>OD<SUB>260</SUB></TD><TD>0.546</TD><TD>0.210</TD><TD>0.072</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>DNA量</TD><TD>546ng/μL</TD><TD>210ng/μL</TD><TD>720ng/μL</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>全量</TD><TD>90μL</TD><TD>95μL</TD><TD>50μL</TD></TR>
 +
:</TABLE>
 +
 +
:(7)　翌日生えていた
 +
 +
:(8)　吸光度(260nm)の測定結果を示す
 +
:<TABLE BORDER="1"><TR>
 +
:<TD></TD><TD>試料A</TD><TD>試料B</TD><TD>試料C</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD ROWSPAN="5"></TD><TD>0.004</TD><TD>0.01</TD><TD>0.057</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.002</TD><TD>0.01</TD><TD>0.05</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.007</TD><TD>0.01</TD><TD>0.053</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.01</TD><TD>0.011</TD><TD>0.054</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>0.004</TD><TD>0.011</TD><TD>0.062</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>平均</TD><TD>0.0054</TD><TD>0.0104</TD><TD>0.0552</TD></TR>
 +
:</TABLE>
 +
::試料A; pSB1A2(BBa_I13522,TetR) → 非常に薄くて使えないことが分かったので破棄
 +
::試料B; ｐSB6A1(BBa_J04450,RFP) → 薄かったけれどとりあえず制限酵素処理をした
 +
::試料C; pSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less) → 薄かったけれどとりあえず制限酵素処理をした
 +
 +
:(9)　まだ濃度が分からない状態。あす以降に吸光度を測定する
 +
:(10)　AcrABはゲル抽出が可能な量を得られなかった
 +
:: これはPCRがうまくいっていなかったと考えられる
 +
:: また、yaiAはアガロースゲルのコームが貫通していたため溶液が流れ出てしまい、ゲル抽出が不可能だった
 +
:: 残りの五つに関しては十分量得られたのでゲル抽出に移った
 +
:(11)各DNA濃度を以下に示した
 +
:<TABLE BOEDER="0"><TR>
 +
:<TD><TABLE BOEDER="0"><TR>
 +
:<TD>SodA</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>1</TD><TD>0.021</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>2</TD><TD>0.021</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>3</TD><TD>0.022</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>4</TD><TD>0.030</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>5 </TD><TD>0.022</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>Ave</TD><TD>0.0232</TD></TR>
 +
:</TABLE></TD>
 +
:<TD></TD><TD></TD>
 +
:<TD><TABLE BORDER="0"><TR>
 +
:<TD>sufA</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>1</TD><TD>0.052</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>2</TD><TD>0.060</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>3</TD><TD>0.053</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>4</TD><TD>0.052</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>5</TD><TD>0.052</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>Ave</TD><TD>0.0538</TD></TR>
 +
:</TABLE></TD>
 +
:<TD></TD><TD></TD>
 +
:<TD><TABLE BORDER="0"><TR>
 +
:<TD>ahpC</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>1</TD><TD>0.055</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>2</TD><TD>0.053</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>3</TD><TD>0.055</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>4</TD><TD>0.055</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>5</TD><TD>0.056</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>Ave</TD><TD>0.0548</TD></TR>
 +
:</TABLE></TD>
 +
:<TD></TD><TD></TD>
 +
:<TD><TABLE BORDER="0"><TR>
 +
:<TD>oxyR</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>1</TD><TD>0.077</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>2</TD><TD>0.078</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>3</TD><TD>0.078</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>4</TD><TD>0.071</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>5</TD><TD>0.077</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>Ave</TD><TD>0.0762</TD></TR>
 +
:</TABLE></TD>
 +
:<TD></TD><TD></TD>
 +
:<TD><TABLE BORDER="0"><TR>
 +
:<TD>dps</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>1</TD><TD>0.072</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>2</TD><TD>0.093</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>3</TD><TD>0.091</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>4</TD><TD>0.080</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>5</TD><TD>0.074</TD></TR>
 +
:<TR>
 +
:<TD>Ave</TD><TD>0.082</TD></TR>
 +
:</TABLE>
 +
:</TD></TR></TABLE>
 +
 +
:(12)　次の日(12日)にコロニーがはえていた
 +
::コロニー数は非常に少ない。これは時間の関係上回復培養を行っていなったためでると考えられる
 +
 +
'''Consideration'''
 +
:(5)　4つの試料のゲル抽出が成功しなかったのはミニプレ後の試料のDNA濃度が不十分であったためであると考えられる

Latest revision as of 17:06, 25 October 2010

Contents

September 5

>>top

Time

9：30～

Member

岩城、竹内、吉村
Iwaki,Takeuchi,Yoshimura

Purpose

  1. The insertion of a target plasmid is confirmed by pSB1C3(J04450) digestion by restriction enzymes.[Iwaki]
  2. Isolation of pSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507) and pSB6A1(K121013) fragments from agarose gel.[Yoshimura,Takeuchi]
  3. DNA ligation and Transformation.[Iwaki,Takeuchi]
(1)　前日にシングルコロニーピックアップをしたpSB1C3(J04450)を
制限酵素処理を行うことにより、目的プラスミドの挿入を確認した
(2)　プロモーター挿入用のpSB6A1(K121013),pSB1A2(I13507)
インサートを切り出してI13507の挿入用のpSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出
(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション

Method

(1)　pSB1C3のプラスミド抽出と制限酵素処理による確認
　前日に2つのシングルコロニーをピックアップし2 mlのLB培地(+Cam)で37℃で一晩培養した
　↓1.5 mlをチューブに採った
　↓25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
　↓上清をカラムに入れた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓カラムを新しいチューブに乗せ換えた
　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　それぞれ10 µlを別のチューブに採った
　↓H bufferを5 µl加えた
　↓蒸留水を34 µl加えた
　↓EcoRⅠとPstⅠを0.5 µlずつ加えた
　↓37℃で1.5時間インキュベートした
　↓1 %ゲルを用いて、100 Vで25分間電気泳動した
　↓20分間EtBrで染色した
　↓紫外線を照射し写真を撮影した
(2)　pSB6A1(K121013)の制限酵素処理とゲル抽出
　PCR用のpSB6A1,RFP,pSB6A1を右表1,2の組成で平常通り制限酵素処理した
　↓右表3,4の組成でゲルにアプライした
　↓50Vで30分間電気泳動した
　↓UVを照射してゲルを切り出した
　↓H2O　400μLを加えた
　↓65℃　40minでヒートブロック
　↓Phe等量加えて　vortex
　↓cfg.　14500rpm　5min　25℃
　↓上清を新チューブへ
　↓Phe/Chl等量　voltex　　
　↓cfg. 14500rpm　5min　25℃
　↓上清を新チューブへ
　↓3M CH3COONa　50μLを加えた
　↓イソプロ　800μLを加えた
　↓cfg.　14500rpm　10min　4℃
　↓上清除き、70％EtOH 150μL
　↓cfg.　14500rpm 5min 4℃
　↓遠心乾燥機　5min
　↓MilliQ　10μLを加えた
表1: PCR用pSB6A1
DNAsol262μL
EcoRⅠ4μL
XbaⅠ4μL
Buffer M30μL
total300μL
表2: RFP,pSB6A1
DNAsol85μL
EcoRⅠ2.5μL
PstⅠ2.5μL
Buffer H10μL
total100μL
表3: PCR用のpSB6A1
DNA300μl
Orange Loading Dye50μl
表4: RFP,pSB6A1
DNA100μl
Orange Loading Dye20μl
(3)　ライゲーションとトランスフォーメーション
　コンピテントセルにDNAを入れた
　↓20分間氷冷した
　↓43℃のウォーターバスに45秒間いれた
　↓5分間氷冷した
　↓SOC培地を900μl加えた
　↓20分間,37℃のインキュベーターに入れた
　↓13000rpm,4℃,1分間遠心した
　↓培養液を少し捨て量を減らし、ピペッティングした
　LBプレートにまき、37℃のインキュベーターに入れてovernight


Results

(1)　以下のようにサンプルを泳動した
レーン11Kb Maker
レーン2コロニー1から抽出したプラスミド
レーン3コロニー1から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの
レーン4コロニー2から抽出したプラスミド
レーン5コロニー2から抽出したプラスミドを制限酵素処理したもの
レーン2と4で同じ長さのバンドが確認できた
またレーン3と5では2本のバンドが確認でき、3と5で長さに違いはなかった
(2)　RFPのバンドが見られなかった
(3)　全てのプレートでコロニーの生育が見られた

Consideration

(1)　pSB1C3はベクター2072bp・インサート1069bpであり、
インサート部分の両端に今回使用した制限酵素で切断できる部位をもつので
電気泳動の結果と照らし合わせるとどちらのコロニーも目的プラスミドの挿入がなされていると考えられる
これを用いてマスタープレート・グリセロールストックの作成をする
(2)　制限酵素処理に失敗したと思われる

September 6

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Time

8:30～20:30

Member

岩城
Iwaki

Purpose

  1. DNA miniprep of pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430) and pSB6A1(K121013).[Iwaki]
  2. pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013) digestion by restriction enzymes.[Iwaki]
  3. Isolation of pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430) and pSB6A1(K121013) fragments from agarose gel.[Iwaki]
  4. Ligation of RFP-pSB6A1(K121013),CFP-pSB6A1(K121013) and YFP-pSB6A1(K121013).[Iwaki]
(1)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のプラスミドを抽出する
(2)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)を制限酵素処理する
(3)　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)のゲル抽出
(4)　RFP・CFP・YFPをpSB1A2からpSB6A1に乗せ換える
AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターをpSB6A1(K121013)のRBSの前に挿入する

Method

(1)　プラスミド抽出
　pSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430), pSB6A1(K121013)の
　4種のプラスミドの抽出をした(カラムを使用したミニプレップ)
(2)　制限酵素処理
　(1)で抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
　(1)で抽出したpSB6A1(K121013)を2つに分け、RFP,CFP,YFP用とpromoter用とした
　RFP,CFP.YFP用をEcoRⅠとPstⅠの2種の制限酵素で切断した
　promoter用をEcoRⅠとXbaⅠの2種の制限酵素で切断した
(3)　ゲル抽出
　(2)で制限酵素処理したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の
　インサートと pSB6A1(K121013)のベクターのゲル抽出を行った(青ゲル)
(4)　LigationとTrans formation
　(3)でゲル抽出したpSB1A2(I13507), pSB1A2(E0420), pSB1A2(Eo430)の3種の
　インサートと pSB6A1(K121013)(RFP,CFP,YFP用)のLigationを行った
　前日にゲル抽出済みの AcrAB,SodA,yaiAの3種のプロモーターと
　(3)でゲル抽出したpSB6A1(K121013)(promoter用)のLigationを行った　
　LigationしたものをTFして、プレートを37℃・overnightでインキュベートした

Results

ゲル抽出の際にpSB1A2(I13507)のバンドが確認できなかったため抽出できなかった
それ以外に関してはTFまで完了した
以下の計5種
　　pSB6A1(E0430)
　　pSB6A1(E0420)
　　pSB6A1(K362007)
　　pSB6A1(K362011)
　　pSB6A1(K362013)

Consideration

試験管3本分ではゲル抽出でバンドがでない可能性が高い
確実にゲル抽出するためには5本以上の試験管での培養が必要と考えられる

September 7

>>top

Time

9：00～

Member

岩城、福山、竹内、中村
Iwaki,fukuyama,Takeuchi,Nakamura

Purpose

  1. Picking up single colony of pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507),pSB6A1(E0430),pSB6A1(K362011) and pSB6A1(K362039).[Fukuyama]
  2. Concentrate AcrAB by Phenol/chloroform and digestion by restriction enzymes.[Fukuyama]
  3. DNA miniprep of pSB1A2(I13507).[Fukuyama]
  4. PCR of AcrAB.[Nakamura]
  5. DNA miniprep of pSB1A2(I13507).[Iwaki,Takeuchi]
  6. DNA miniprep of lacZ.[Takeuchi]
(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507),
pSB6A1(E0430),pSB6A1(K362011),
pSB6A1(K362039)のコロニーをピックアップ [福山]
(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理　[福山]
(3)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップと濃縮　[福山]
(4)　AcrABのPCR　[中村]
(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
(6)　lacZのアルカリミニプレップ

Method

(1)　コロニーをピックアップ
　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507),
pSB6A1(E0430),pSB6A1(K362011),
pSB6A1(K362039)
　それぞれのコロニーを32個ずつピックアップし、LBプレート(+amp)にストリークした
　↓37℃でインキュベートした
(2)　AcrABのフェノール/クロロホルム処理と制限酵素処理
　PCR処理済みのAcrAB溶液400μlにMilliQ200μl加えた
　↓フェノールクロロホルム溶液を1.2mlほど加えてピペッティングし、vortexした
　↓室温、14,500rpmで5分間遠心した
　↓上清を回収し、これに2-プロパノールを1.2mlほど加えた
　↓4℃、14,500rpmで10分間遠心した
　↓上清を捨て、70％エタノールを1.2mlほど加えた
　↓4℃、14,500rpmで3分間遠心した
　↓上清を捨てた
　↓遠心乾燥機で乾燥した
　↓MilliQを30μl加えた
　↓5μlとって2％アガロースゲル電気泳動で確認した(300bpあたりにバンドが見えた)
　↓100倍希釈で吸光度を計測した
　↓濃縮したプラスミド溶液24μlに下表2に従い各試薬を加えた
　↓調整した試料を37℃で一晩インキュベートした
表1: 吸光度計測結果
AD2600.071
0.069
0.069
0.07
0.071
平均0.07
表2: 試薬組成
AcrAB24μl
EcoRⅠ0.84μl
PstⅠ0.933μl
H Buffer2.6μl
MilliQ21.6μl
全量約50μl


(3)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップと濃縮
　pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした
　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓20℃、14,500rpmで5分間遠心した
　↓上清をカラムに入れた
　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓20℃、14,500rpmで1分間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水をカラムに入れた
　↓20℃、14,500rpmで30秒間遠心した
　↓溶出液を回収した
　↓溶出液量に対して酢酸ナトリウムを1/10倍、イソプロパノールを等量加えて混ぜた
　↓4℃、14,000rpmで10分間遠心した
　↓上清を捨て、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
　↓4℃、14,000rpmで5分間遠心した
　↓上清を捨て、遠心乾燥機で乾燥した
　↓MilliQを30μl加えた
(4)　AcrABのPCR
　下表1,2に示した試薬組成、設定に従ってPCRを行った
組成
AcrABM1.5μL
Buffer5μL
dNTPs5μL
KOD-Plus1μL
MgSO44μL
鋳型DNA0.5μL
H2O33μL
Total50μL
PCR設定
熱変性熱変性アニーリング伸長反応伸長反応保存
94℃94℃60.2℃68℃68℃4℃
5min15sec30sec20sec2min∞
30サイクル
(5)　pSB1A2(I13507)のアルカリミニプレップ
　pSB6A1(I13507), pSB6A1(E0420), pSB6A1(E0430)のカラム使用アルカリミニプレップ
　25℃、14,500rpmで1分間遠心して集菌した
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓25℃、13,000rpmで5分間遠心した
　↓上清をカラムに入れた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓25℃、13,000rpmで30秒間遠心した
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水を100 µlカラムに入れた
　↓電気泳動した
(6)　lacZのアルカリミニプレップ
　集菌後、水分を十分に取り除き、SolutionⅠ250μLを加えた
　↓vortexにより混合した後、SolutionⅡ250μLを加え、上下に2，3度転倒させて混ぜた
　↓SolutionⅢ350μLを加え、よく混合した
　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min
　↓上清をカラムに移した
　↓cfg.　25℃　13,000rpm　30sec　カラム下部の液を捨てた
　↓SolutionⅣ500μLを加えた
　↓cfg.　20℃　13,000rpm　1min　カラム下部の液を捨てた
　↓SolutionⅤ700μLを加えた
　↓cfg.　25℃　13,000rpm　1min×２
　↓酢酸ナトリウム50μL、イソプロパノール800μLを加えた
　↓cfg.　25℃　13,000rpm　10min
　↓上清を除いた
　↓70%EtOHをエッペンの8分目まで加えた
　↓cfg.　25℃　13,000rpm　5min
　↓遠心乾燥　2min
　↓滅菌水100μLに溶かした

Results

(1)　翌日プレート上で各プラスミドを持つ大腸菌が培養出来ているのを確認した
(2)　制限酵素処理が上手くいったかどうかは確認できていない
翌日以降、電気泳動によって確認し、問題がなければゲル抽出する
(3)　どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
翌日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う
(4)　ゲル抽出をするのに十分な濃度の試料を得ることができた。
(5)　バンドは検出できなかった、iGEMの製作した試薬には問題ありと考えられる
(6)　lacZの吸光度は0,1468（×1/100）でDNA濃度は734g/μLであった
　　　→冷蔵保存

September 8

>>top

Time

9：00～

Member

岩城、福山、古道、竹内、中村
Iwaki,Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Nakamura

Purpose

  1. DNA miniprep of pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420) and pSB1A2(E0430).And concentration of those.[Fukuyama]
  2. Cultivate pSB6A1（E0420).[Fukuyama]
  3. PCR of SodA,OxyR and yaiA.[Furumichi]
  4. SodA,OxyR and yaiA concentrate by phenol/chloroform.[Furumichi]
  5. 2-propanol precipitation of pSB1C3.[Nakamura]
(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮
(2)　pSB6A1（E0420）の培養
(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR
(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理
(5)　pSB1C3のイソプロ沈

Method

(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(E0420),pSB1A2(E0430)のアルカリミニプレップと濃縮
　4時間ほどLB液体培地で培養した各E.Coliをそれぞれ1.5mlエッペンに8割ほど移した
　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
　↓上清をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓遠心30秒(20℃、14500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓溶出液を回収
　↓酢酸ナトリウムとイソプロパノールを溶出液量に対して
　　それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた。
　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
　↓MilliQを各種プラスミドにつき30μlずつ加えた
(2)　pSB6A1（E0420）の培養
　前日にAmp入りLB寒天培地にストリークしたpSB6A1(E0420)を
　2mlのLB液体培地が入った試験管6本に一部うつして　　　　　
　振とう培養した
(3)　SodA,OxyR,yaiAのPCR
　プライマー(Forward)、プライマー(Reverse)を
　すでにMixしたプライマー(SodA, OxyR,yaiA)を各1.5μLずつ、500μLのエッペンに入れた
　↓それぞれのエッペンに下表1の組成で溶液を加えた
　↓下表2,3のプログラムでPCR反応を行った
　↓PCR産物を電気泳動にかけた
表1: 試薬組成
テンプレートDNA(DH5α)各0.5μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-5μL
2mM d NTPs5μL
2mM MgSO44μL
MilliQ33μL
KOD-Plus-1μL
total50μL
表2: SodA,OxyRのPCR反応
熱変性熱変性アニーリング伸長反応伸長反応保存
94℃94℃62.7℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec1min2min保持
30サイクル
表3: yaiAのPCR反応
熱変性熱変性アニーリング伸長反応伸長反応保存
94℃94℃60.4℃68℃68℃4℃
2min15sec30sec38sec2min保持
30サイクル
(4)　PCR済のSodA,OxyR,yaiAのフェノールクロロホルム処理
　PCR済のSodA, OxyR,yaiAにそれぞれ200µlずつ滅菌水を加えた
　↓フェノールクロロホルム(φ OH/CIAA)200µl加えた
　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した
　↓上清を回収しそれにクロロホルムイソアミルアルコール(CIAA)を200µl加えボルテックスした
　↓4℃、14,000rpmで10min遠心した
　↓上清を回収しそれに3M CH3COONaを50µl加え混ぜた
　↓イソプロパノール0.5ml加えて混ぜ4℃、14,000rpmで20min遠心した
　↓上澄みを捨て70％エタノール200µl加え4℃、14,000rpmで10min遠心した
　↓上澄みを捨てて乾燥させた
　↓滅菌水を30µl加えた
　↓冷蔵保存した
(5)　pSB1C3のイソプロ沈
　TEに溶かした状態のpSB1C3ベクター50μLに、CH3COONa50μL、イソプロパノール800μLを加えた
　↓cfg.　25℃　13,000rpm　15min
　↓上清を捨てた
　↓70%EtOH800μLを加えた
　↓cfg.　25℃　14,500rpm　5min
　↓EtOHを除いた
　↓遠心乾燥　2min
　↓滅菌水30μLに溶かした

Results

(1)　まだどれほどの量でプラスミドが回収できたのかは分からない
(2) 培養に成功していれば明日にもアルカリミニプレップを行う予定
(3)　PCR産物を電気泳動にかけた結果、すべて、バンドが検出されたので、今後使用するものとする
(4)　実験(3)で得られたPCR産物のクロロホルム処理を行い冷蔵保存した
これを次回の実験に用いる(制限酵素処理など)
(5)冷蔵保存

September 9

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Time

9：00～

Member

竹内、中村、吉村
Takeuchi,nakamura,Yoshimura

Purpose

  1. DNA miniprep of pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507).[Yoshimura]
  2. Isolation of pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430) and pSB1A2(R0040) fragments from agarose gel.[Yoshimura]
  3. Absorbance determination of oxyR, sodA, and yaiA.[Nakamura]
(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出　[吉村]
(2)　(1)と前日(9/8)にプラスミド抽出した
pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出　[吉村]
(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定　[中村]

Method

(1)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)のプラスミド抽出
　pSB6A1(E0420),pSB6A1(I13507)を1.5mlエッペンチューブにうつした
　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
　↓上清をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓溶出液を回収
　↓CH3COONaとイソプロパノールを
　　溶出液量に対してそれぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
　↓MilliQを30μl加えた


(2)　pSB6A1(E0420),pSB6A1(E0430),pSB1A2(R0040)のゲル抽出
　今回は青ゲルを使わずにUV照射でバンドの位置を確認してゲル抽出を行う方法をとった
　DNAを下表1,2,3のように制限酵素処理した
　↓3時間,37℃でインキュベート
　↓アガロースゲルに下表4の全量をapplyした
　↓50V,50minで電気泳動した。
　↓20min EtBrに浸した
　↓暗室でUVをゲルに照射し、バンドの位置を確認してゲルを切り出した
表1: CFP
DNA40μl
EcoRⅠ1.5μl
XbaⅠ1.5μl
M Buffer5μl
milliQ2μl
total50μl
表2: RFP,YFP
DNA30μl
EcoRⅠ1.5μl
XbaⅠ1.5μl
M Buffer5μl
milliQ12μl
total50μl
表3: TetR
DNA30μl
EcoRⅠ1.5μl
PstⅠ1.5μl
H Buffer5μl
milliQ12μl
total50μl
表4: 試薬組成
Marker(1kb)3μl
Loadiing Buffer10μl
DNA全量
(3)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定
冷蔵保存されていたoxyR、sodA、yaiA on pSB6A1をそれぞれ、100倍希釈で吸光度測定した

Results

(2,3)　CFP,YFP,TetRはバンドが見え、切り出しに成功した
　⇒冷蔵庫に保存、翌日のLigationに使用する
　RFPはバンドが見えなかった
　⇒ミニプレの必要あり
(4)　oxyR、sodA、yaiAの吸光度測定結果(100倍希釈)
吸光度DNA濃度
oxyR0.018(5回平均)90ng/μL
sodA0.058(5回平均)290ng/μL
yaiA0.029(5回平均)145ng/μL

September 10

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Time

9：00～

Member

福山、竹内、臼井、吉村
Fukuyama,Takeuchi,Usui,Yoshimura

Purpose

  1. Cultivate of pSB1A2(I13522) and pSB1A2(J04450).[Usui]
  2. Ligation of pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430) and pSB1A2(R0040).[Yoshimura]
  3. Activity of ahpC and sufA is examined.[Usui]
  4. All promoter digestion by restriction enzymes.[Usui]
  5. DNA miniprep of pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450) and pSB1A2(I13522).And concentration of those.[Fukuyama]
  6. To examine the promoter activity in the opposite direction of OxyR, Inverted LacZ is made by PCR. [Yoshimura]
(1)　pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)の培養　[臼井]
(2)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション　[吉村]
(3)　ahpC,sufAの活性確認　[臼井]
(4)　全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理　[臼井]
(5)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮　[福山]
(6)　OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する　[吉村]

Method

(1)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450)の培養
　pSB1A2(I13522),pSB1A2(J04450)をマスタープレートより白金耳でひっかき、
　LB(+amp)の培地3mLで各3本ずつ37℃で培養した
(2)　pSB1A2(E0420),pSB1A2(I13507),pSB1A2(E0430)とpSB1A2(R0040)のライゲーション
[1] CFP,RFP,YFP,TetR-GFPのDNAのゲルからの抽出
　切りだしたゲルを入れたエッペンに400μlのmilliQを入れた
　↓65℃でゲルを溶かした
　↓フェノールをエッペンの8割くらいまでいれて、vortexした
　↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した
　↓上清を回収し、フェノールクロロホルムをエッペンの8割くらいまで加えた
　↓14,500rpm,5min,4℃で遠心した
　↓上清を回収し、イソプロパノール 800μl,CH3COONa 50μlを加えた
　↓14,500rpm,10min,4℃で遠心した
　↓70％EtOH 200μlを加えた
　↓14,500rpm,3min,4℃で遠心した
　↓遠心乾燥器にかけた
　↓30μlのmilliQに溶かした後吸光度を測定しDNA濃度を調べた
[2] pSB6A2(k121013)とpSB1A2(I13522)のligation
　ligationはT-4ligaseを用いて以下の条件で行った
A(insert:vector=1:2)
Insert(TetR-GFP)1μl
Vevtor(pSB6)7.8μl
Buffer1μl
T-4ligase1μl
MilliQ0μl
Total10.8μl
B(insert:vector=1:10)
Insert(TetR-GFP)1μl
Vevtor(pSB6)4.2μl
Buffer1μl
T-4ligase1μl
MilliQ3μl
Total10μl
　A、B両サンプルをそれぞれ16℃で1時間インキュベートした
　以上の2サンプルについては以下の条件でトランスフォーメーションを行った
　　DH5α50μlに以上の2サンプル全量を加え混ぜた後、30分間氷上で静置した
　　↓43℃で40秒インキュベートした後、10分間氷上で静置した
　　↓この各サンプルをLBプレート(+amp　終濃度50μg/ml)にまき37℃でインキュベートした(overnight)


(3)　ahpC,sufAの活性確認
　ahpC,sufAに関して100倍希釈の吸光度5回測定し、平均値より各濃度を算出した
ahpC
1回目0.211
2回目0.210
3回目0.204
4回目0.200
5回目0.198
Ave0.2046
濃度1023ng/μL
sufA
1回目0.161
2回目0.164
3回目0.165
4回目0.160
5回目0.159
Ave0.1618
濃度809ng/μL
(4)　全プロモーター(予備は除く)の制限酵素処理
　ahpC(全量240μL),AcrAB(全量45μL),dps(全量195μL),SodA(全量135μL),
　sufA(全量240μL),oxyR(全量45μL),yaiA(全量135μL)の七種類のプロモーターに関して、
　濃縮を以下の手順で行い、制限酵素処理を行った
[濃縮]
　DNA溶液の全量をxμLとして、DNA溶液に1/10x μL　3M CH3COONa,x μL　isopropanolを加えた
　↓cfg.14000rpm,20min,4℃
　↓上清を捨て、70%EtOHを加えた
　↓cfg.14000rpm,10min,4℃
　↓上清を捨て遠心乾燥 30sec.
　↓それぞれのDNAにH2O 30μLを加えた
[制限酵素処理]
＜組成＞
DNAサンプル30μL
10×H-Buffer4μL(1×として使用)
EcoRⅠ0.4μL
SpeⅠ0.2μL
H2O5.4μL
Total40μL
　これを37℃,overnightで培養した


(5)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)のアルカリミニプレップ、濃縮
pSB1A2(I13522),pSB6A1(J04450),pSB1A2(I13522)を
それぞれ別々に1.5mlエッペンチューブにうつした
　↓遠心１分（20℃、14500rpm）して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
　↓上清をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓溶出液を回収
　↓CH3COONaとイソプロパノールを溶出液量に対して、それぞれ1/10倍、等量加えてまぜた
　↓遠心10分(4℃、14,000rpm)
　↓上清をすて、70％エタノールを各エッペンに800μlずつ加えた
　↓遠心5分(4℃、14,000rpm)
　↓上清をすて、遠心乾燥機で乾燥
　↓TE(10μlTris-HCl pH8.0/1mM EDTA)をそれぞれ30μlずつ加え、冷蔵庫で保管した
(6)　OxyRの逆向きのプロモーター活性を調べるためにInverted LacZをPCRにより作成する
[1]Inverted LacZ 作成のためのPCR
　鋳型DNAとしてiGEMで登録されているpSB1A2(I732019)を用いた
　PCRの条件は以下の条件で行った
Sample A
鋳型DNA(810ng/ul)0.5ul
MgSO41ul
dNTP2ul
KODplus0.5ul
Primer(forward)0.5ul
Primer(Reverse)0.5ul
Buffer2ul
MilliQ13ul
Total20ul
Sample B
鋳型DNA(810ng/ul)0.5ul
MgSO42ul
dNTP2ul
KODplus0.5ul
Primer(forward)0.5ul
Primer(Reverse)0.5ul
Buffer2ul
MilliQ12ul
Total20ul
PCR反応
熱変性熱変性アニーリング伸長反応伸長反応保存
94℃94℃63℃75℃75/TD>4℃
2min30sec30sec30sec10min保持
35サイクル
　合成したプライマーを以下に示した
Primer(forward)5’-CAGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGTATAAACGCAGAAAGGCCCA
Primer(Reverse)5’-ACGTACTAGTAGCGGCCGCTGCAGAAAGAGGAGAAATACTAGAT
　以上の条件によりPCRで増幅させたサンプルを電気泳動し、増幅の確認を行った

Results

(1)　翌日、培養の成功を確認した
(2) それぞれのDNA濃度を以下にまとめた
　　　CFP 280ng/μl
　　　YFP 450ng/μl
　　　TetR－GFP 400ng/μl
翌日コロニーができていた
(3) 濃度の測定で十分量と判断し、以後の実験に使用した
(4) 翌日11日に結果記載
(5) どれくらい各プラスミドが回収できたのかはまだ分からない状態である
明日以降、各プラスミド溶液の吸光度をはかり、制限酵素処理を行う
(6) Ⅰのサンプルではバンドがみられなかったが、Ⅱのサンプルではバンドが見えた
　　　⇒Ⅱのサンプルでバンドが見られたことから、次回からPCRするにはⅡの条件で行うのがよい
TetR-GFPのインサートが937bpなので、今回得られたバンドは少しそれより長いものと考えられる
急ぎなのでこのまま使用するが、本来ならカットチェックを行う必要がある

September 11

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Time

9：00～

Member

福山、古道、竹内、臼井、革島、中村
Fukuyama,Furumichi,Takeuchi,Kawashima,Nakamura

Purpose

  1. Picking up single colony of pSB6A1(I13522) and DNA miniprep of pSB6A1(I13522).[Takeuchi]
  2. Streaking of pSB6A1(I13522).[Furumichi]
  3. Cultivate of pSB6A1(K362036) and miniprep of this and digestion by restriction enzymes.[Usui]
  4. PCR of lacZ and digestion by restriction enzymes .[Takeuchi]
  5. Isolation of promoter fragments from agarose gel.[Furumichi]
  6. DNA miniprep of lacZ and digestion by restriction enzymes.[Takeuchi]
  7. Pre-culture of pSB1A2(I13522),pSB6A1(K121013),pSB6A1(I13522).[Kawashima]
  8. Measurement of absorbance of pSB6A1(J04450),pSB6A1(I13507) and pSB1A2(I13522) and digestion by restriction enzymes.[Kawashima]
  9. DNA miniprep of pSB6A1(K362036).[Fukuyama]
  10. Isolation of SodA,sufA,ahpC,oxyR and dps fragments from agarose gel.[Usui]
  11. Ligation of SodA,sufA,ahpC,oxyR and dps.[Usui]
(1)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のピックアップ、ミニプレップ　[竹内]
(2)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のストリーク　[古道]
(3)　pSB6A1(K362036)の培養6本→アルカリミニプレップ→制限酵素処理(over night)　[臼井]
(4)　LacZ(inverted)のPCR2本、35サイクル→制限酵素処理(over night)　[竹内]
(5)　Promoterのゲル抽出(全種類)　[古道]
(6)　プロモーターレスLacZの ミニプレ→制限酵素処理　[竹内]
(7)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(K121013),pSB6A1(I13522)のプレカルチャー　[革島]
(8)　前日にアルカリミニプレップした
pSB6A1(J04450),pSB6A1(I13507),pSB1A2(I13522)
の吸光度の測定と制限酵素処理　[革島]
(9) pSB6A1(K362036)のアルカリミニプレップ　[福山]
(10)　AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの電気泳動　[福山]
(11)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのゲル抽出　[臼井]
(12)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのライゲーション　[臼井]

Method

(1)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のピックアップ、ミニプレップ
　ライゲーション済pSB6A1(I13522)をピックアップした
　↓4時間程37℃振とう培養した
　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
　↓上清をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓溶出液を回収
(2)　ライゲーション済pSB6A1(I13522)のストリーク
　amp入りLBプレートにライゲーション済pSB6A1(I13522)をストリークした
(3)　pSB6A1(K362036)の培養6本→アルカリミニプレップ→制限酵素処理(over night)
　試験管で培養した試料をカラムなしのミニプレ処理を行いDNAを抽出した
　そして、抽出後の試料にEcoRⅠ,PstⅠでの制限酵素処理を行った
　組成を下表1に示した
表1: 制限酵素処理組成
DNAsol3μL
EcoRⅠ1μL
PstⅠ1μL
10×H5μL
H2O40μL
Total50μL
(4)　LacZ(inverted)のPCR2本、35サイクル→制限酵素処理(over night)
　Inverted lacZのPrimer(forward)1.5μl、Primer(Revese)1.5μlを500μlエッペンに分注した
　↓それぞれのエッペンに下表2の組成で溶液を加えた
　↓下表3に示したプログラムでPCR反応を行った
　↓PCR済のInverted lacZの吸光度測定し、DNA濃度を算出した
　↓下表4の組成でエッペンに分注し、制限酵素処理を行った
　↓これを37℃でインキュベートした(overnihgt)
表2: 試薬組成
pSB1A2(BBa-I732019)各 1μL
10×PCR Buffer for KOD-Plus-5μL
2mM d NTPs5μL
2mM MgSO44μL
MilliQ31μL
KOD-Plus-1μL
表3: PCR反応
熱変性熱変性アニーリング伸長反応伸長反応保存
94℃94℃63℃75℃75℃4℃
2min30sec30sec30sec10min保持
35サイクル
表4: 制限酵素処理
PCR済Inverted lacZAB
DNA40μl40μl
EcoRⅠ1.796μl0.94μl
SpeⅠ0.997μl0.522μl
Buffer H5μl5μl
Milli Q2.207μl3.538μl
total50μl50μl
(5)　Promoterのゲル抽出(全種類)

AcrAB,ahpC,dps,oxyR,,SodA,sufA,yaiA過酸化水素応答性プロモーター7種類に対して カラムを使わないゲル抽出を行った

(6)　プロモーターレスLacZの ミニプレ→制限酵素処理
　遠心1分(20℃、14,000rpm)して集菌(菌液を使いきるまで)
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、よくボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓遠心5分(20℃、14,000rpm)
　↓上清をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,000rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓溶出液を回収
　プロモーターレスLacZの制限酵素処理
　EcoRⅠ、pstⅠでカット。Total50μL


(7)　pSB1A2(I13522),pSB6A1(K121013),pSB6A1(I13522)のプレカルチャー
　プレートを4分割してそれぞれをストリーク、1つはNothingとした
　↓37℃でインキュベートした(over night)
(8)　pSB6A1(J04450),pSB6A1(I13507),pSB1A2(I13522)
の吸光度の測定と制限酵素処理
　前日にアルカリモニプレップと濃縮を終えていた3試料を100倍希釈して吸光度(260nm)を測定した
試料ApSB6A1(BBa_J04450,RFP)
試料BpSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less)
試料CpSB1A2(BBa_I13522,TetR)
　↓下表5に従い試料を調整した
　↓37℃でインキュベート
表5: 試薬組成
試料B(μl)試料C(μl)
DNA溶液2929
EcoRⅠ0.150.8
SpeⅠ0.085
XbaⅠ0.89
Buffer H55
Milli Q15.814.31
合計約50約50
(9) pSB6A1(K362036)のアルカリミニプレップ
　遠心1分(20℃、14,500rpm)して集菌
　↓上清を捨てた
　↓SolutionⅠを250μｌ加えてピペッティングし、ボルテックスした
　↓SolutionⅡを250μl加えた
　↓SolutionⅢを350μl加えた
　↓遠心5分(20℃、14,500rpm)
　↓上清をカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅣを500μlカラムに加えた
　↓遠心1分(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓SolutionⅤを700μlカラムに加えた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓抽出液を捨てた
　↓滅菌水100μlをカラムに入れた
　↓遠心30秒(20℃、14,500rpm)
　↓溶出液を回収した
(10)　AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの電気泳動
　前日(10日)にEcoRⅠ-SpeⅠでカットしておいた
　AcrAB,SodA,sufA,ahpC,oxyR,yaiA,dpsの七種類のプロモーターに関して
　1%アガロースゲル(ゲル抽出用)で50V-45minの条件で電気泳動を行った
(11)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのゲル抽出
＜方法＞
　抽出(QIAGENのQIAquick®Gel Extraction kit(250)を使用)
　切りだしたゲルの重さを事前に量った
　↓ゲルの三倍量のBufferQGを加え、50℃-10minでインキュベート
　↓ゲルの溶解後、ゲルと等量のisopropanolを加え、カラムに乗せた
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓抽出物を捨て、0.5mLのBufferQGを加えた。
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓抽出物を捨て、0.75mLのBufferPEを加えた。
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓抽出物を捨て、エッペンにカラムを乗せかえH2Oを37μL加えた。
　↓cfg.10,000rpm-1min
　↓内5μLを濃度測定に使用した(H2Oを95μL加え20倍希釈とした)
(12)　SodA,sufA,ahpC,oxyR,dpsのライゲーション
　CFP-On pSB6(ローコピーベクター)、各種プロモーターおよび、
　YFP-On pSB6(ローコピーベクター)、各種プロモーターのligation
　ligationはT-4lagaseを用いligation条件を以下の条件で行った
CFP-on pSB6,各種プロモーターのligation
[Ⅰ] insert:vector=1:2
Insert(sufA)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)2.4μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q0.2μl
Total10μl
Insert(sodA)6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)1.3μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q0.9μl
Total10μl
Insert(ahpC)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)2.5μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q0.7μl
Total10μl
Insert(oxyR)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)3.4μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q0μl
Total10μl
Insent(dps)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)3.6μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q0.2μl
Total10μl


YFP on pSB6,各種プロモーターのligation
[Ⅰ] insert:vector=1:2
Insert(sufA)6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)1.8μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q0.4μl
Total10μl
Insert(sodA)6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)0.8μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q1.4μl
Total10μl
Insert(ahpC)6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)1.9μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q0.3μl
Total10μl
Insert(oxyR)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)2.5μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q0.7μl
Total10μl
Insent(dps)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)2.7μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q0.5μl
Total10μl


CFP-on pSB6,各種プロモーターのligation
[Ⅱ] insert:vector=1:5
Insert(sufA)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)1μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q2.2μl
Total10μl
Insert(sodA)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)0.4μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q2.8μl
Total10μl
Insert(ahpC)6μl
Vevtor(CFP-On pSB6)1μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q1.2μl
Total10μl
Insert(oxyR)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)1.4μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q2.8μl
Total10μl
Insent(dps)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)1.5μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q2.7μl
Total10μl


YFP-on pSB6,各種プロモーターのligation
[Ⅱ] insert:vector=1:5
Insert(sufA)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)0.6μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q2.6μl
Total10μl
Insert(sodA)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)0.3μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q2.9μl
Total10μl
Insert(ahpC)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)0.6μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q2.6μl
Total10μl
Insert(oxyR)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)0.85μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q2.35μl
Total10μl
Insent(dps)5μl
Vevtor(CFP-On pSB6)0.9μl
Buffer1μl
T-4ligase0.8μl
Milli Q2.3μl
Total10μl
以上の条件で作成したすべてのサンプルについてトランスフォーメーションを行い大腸菌に形質転換させた
　DH5α50μlに以上のサンプル全量をそれぞれ加え混ぜた後、3min氷上で静置した
　↓43℃で30秒インキュベートした後、10分間氷上で静置した
　↓この各サンプルをLBプレート(+amp 終濃度50μg/ml)にまき37℃でインキュベートした(overnight)

Results

(1)　ライゲーション済TetR・GFPのミニプレップ処理後は保存し、次回吸光度測定をした
(2)　翌日生えていた
(3)　十分な量のDNAを抽出できたので予定通り、制限酵素処理を行った。
(4)
PCR済Inverted lacZ①吸光度(100倍希釈)
0.094
0.090
0.089
0.091
0.085
平均0.0898
DNA濃度4.49×102(µl/ml)
PCR済Inverted lacZ①吸光度(100倍希釈)
0.050
0.046
0.048
0.050
0.041
平均0.0470
DNA濃度2.35×102(µl/ml)
制限酵素処理後はDNA抽出を行う
(5)　AcrAB,ahpC,dps,oxyR,,SodA,sufA,yaiAのうちAcrAB,ahpC,sufAがゲル抽出に成功した
ゲル抽出に成功した試料の濃度は以下の通り
AcrABahpCsufA
濃度28 ng/μL1238 ng/μL640 ng/μL
(6)　プロモーターレスLacZの ミニプレ
Sample1(1/20)Sample2(1/20)Sample3(1/200)
OD2600.5460.2100.072
DNA量546ng/μL210ng/μL720ng/μL
全量90μL95μL50μL
(7)　翌日生えていた
(8)　吸光度(260nm)の測定結果を示す
試料A試料B試料C
0.0040.010.057
0.0020.010.05
0.0070.010.053
0.010.0110.054
0.0040.0110.062
平均0.00540.01040.0552
試料A; pSB1A2(BBa_I13522,TetR) → 非常に薄くて使えないことが分かったので破棄
試料B; ｐSB6A1(BBa_J04450,RFP) → 薄かったけれどとりあえず制限酵素処理をした
試料C; pSB6A1(BBa_I13507,RFP,promoter less) → 薄かったけれどとりあえず制限酵素処理をした
(9)　まだ濃度が分からない状態。あす以降に吸光度を測定する
(10)　AcrABはゲル抽出が可能な量を得られなかった
これはPCRがうまくいっていなかったと考えられる
また、yaiAはアガロースゲルのコームが貫通していたため溶液が流れ出てしまい、ゲル抽出が不可能だった
残りの五つに関しては十分量得られたのでゲル抽出に移った
(11)各DNA濃度を以下に示した
SodA
10.021
20.021
30.022
40.030
5 0.022
Ave0.0232
sufA
10.052
20.060
30.053
40.052
50.052
Ave0.0538
ahpC
10.055
20.053
30.055
40.055
50.056
Ave0.0548
oxyR
10.077
20.078
30.078
40.071
50.077
Ave0.0762
dps
10.072
20.093
30.091
40.080
50.074
Ave0.082
(12)　次の日(12日)にコロニーがはえていた
コロニー数は非常に少ない。これは時間の関係上回復培養を行っていなったためでると考えられる

Consideration

(5)　4つの試料のゲル抽出が成功しなかったのはミニプレ後の試料のDNA濃度が不十分であったためであると考えられる
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